鼠疫防控实用技术:病原学篇
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第四节 鼠疫耶尔森菌的培养特性

一、生长条件

鼠疫菌是典型的异养菌。在普通培养基上可生长,但发育缓慢,接种后48~24小时才能形成肉眼可见的小菌落。
鼠疫菌为需氧菌,也能在厌氧下生长,但适量供氧生长最好,氧压过高反而对生长有害。在厌氧环境生长时,发育缓慢且常出现变形。
生长温度范围为-2~45℃,有人应用低温(4~5℃)培养来抑制杂菌生长以利于鼠疫菌的分离。但最适合发育温度为28℃,也有人认为是25~30℃,在此温度下培育的菌落表面干燥,易于用白金耳从培养基表面刮取,且较易将其均匀地悬浮在生理盐水中;而在37℃培养出的菌落则表面湿润,黏稠且较难刮下,也不易制成均匀悬液。有人证实,当鼠疫菌由最适繁殖温度(28℃)升高到人体体温(37.5℃)时,活菌数减到原来的七分之一或十分之一,毒力反而增强。如某一鼠疫菌株28℃培养物对小白鼠的半数致死量为7个菌细胞,而37℃培养物,则只需一个菌细胞就足够了。
培养基的最适pH为6.9~7.1,但pH在5.8~8.0鼠疫菌均可发育。1943年,Sokhey实验证实鼠疫菌在28℃ pH为5.0~9.6的肉汤中能生长。
鼠疫菌在培养基上发育初期所要求的最适氧化还原电位(Eh)约为100~150mV。如接种在培养基上的菌量较多,鼠疫菌在Eh为20~350mV也能生长。
强毒力的鼠疫菌对钙离子有半依赖性,缺乏时则不能很好生长。
鼠疫菌虽能在普通培养基上生长,但发育缓慢,即使应用目前最好的培养基,如加有生长刺激剂:血液制剂(血清、溶血、血晶质及F1lds煎剂)、维生素B 1、烟酸,马铃薯杆菌、环状芽胞杆菌或猪型布鲁菌滤液等,也需20小时以上才能形成肉眼可见的菌落,如培养基质量差或接种菌量过少,发育至成熟菌落的时间就更长。某些菌株在营养琼脂上生长情况也有差异,如分离自布氏田鼠的鼠疫菌株在普通琼脂培养基上发育速度就十分缓慢,活菌数也少,而在胰酶消化肉汤琼脂培养基上繁殖迅速、发育较快。

二、生长过程

细菌群体的生长繁殖可分为四期:迟缓期、对数期、稳定期、衰亡期(图1-4)。
图1-4 细菌生长繁殖阶段示意图
(一)迟缓期
细菌接种至培养基后,对新环境有一个短暂适应过程(不适应者可因转种而死亡)。此期因细菌繁殖极少,曲线平坦稳定。迟缓期长短因菌种、接种菌量、菌龄以及营养物质等而异,一般细菌为1~4小时,鼠疫菌需4~6小时。此期中细菌体积增大,代谢活跃,为细菌的分裂、增殖、合成,储备充足的酶、能量及中间代谢产物。
(二)对数期
又称指数期,此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长,可持续几小时至几天(视培养条件及细菌代时而异)。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型,对外界环境因素的作用敏感,因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用,对该时期的细菌效果最佳。
(三)稳定期
该期的生长菌群总数处于平坦阶段,但细菌群体活力变化较大。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物(有机酸、H 2O 2等)积累、pH值下降等不利因素的影响,细菌繁殖速度渐趋下降,相对细菌死亡数开始逐渐增加,此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变,并产生相应的代谢产物,如外毒素、内毒素、抗生素以及芽胞等。
(四)衰亡期
随着稳定期发展,细菌繁殖越来越慢,死亡菌数明显增多,活菌数与培养时间呈反比关系,此期细菌变长、肿胀或畸形衰变,甚至菌体自溶,难以辨认其形,生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。
体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响,不会出现像培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律,可有目的地研究控制病原菌的生长,发现和培养对人类有用的细菌。

三、培养特性

鼠疫菌在普通培养基上发育,其群体形态具有一定的稳定性。发育初期首先出现带有突起的短丝和长丝,随后集聚形成丝团,由丝团构成致密的中心,并从中心伸出丝状突起和丝束。此时中心并不发暗,在光学显微镜下显透明的碎玻璃片状。此后发育成典型的微小鼠疫菌落,直径0.1~0.2mm,有光泽,中心圆形突起,无色,一般需培养20小时以上。培养24小时或48小时后,菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色,反射光线下则菌落圆形隆起呈淡灰白色,光学显微镜下可见菌落中心发暗,有黄褐色粗糙颗粒,周边围绕一圈宽窄不等,边缘不整,呈锯齿状、薄而透明的花边。在溶血琼脂上菌落隆起,花边带消失或残留锯齿状痕迹。鼠疫菌这一发育过程以及成熟菌落形态特点,在细菌学诊断上具有一定的鉴别意义(图1-5)。
图1-5 鼠疫菌菌落形态
鼠疫菌在含血琼脂培养基上,生长很好但不典型(菌落中心颗粒粗糙,色泽深,花边窄或无),在诊断上应引起注意,在5%~10%血琼脂平碟上不溶血。用高层琼脂培养时,在琼脂表面和深层均能生长。在琼脂斜面上形成灰白色菌苔,在37℃时较黏稠,不宜用生理盐水制成均匀的菌悬液。
鼠疫菌在肉汤中发育良好,形成絮状沉淀和薄膜。此膜初期薄弱,以后逐渐增厚,紧贴于管壁,呈白色环状,肉汤仍透明。鼠疫菌在烧瓶肉汤内静置培养4~5天后,有长丝状物自液面下悬于透明的肉汤内,底部絮状沉淀堆积,呈现“钟乳石”状发育。
鼠疫菌不液化明胶,在该培养基上生长良好,在表面形成薄膜,沿穿刺线发育,呈现许多小的羽毛状突起,如松树枝状,在明胶平碟上培养3日后,发育成半球形菌落,中心厚而微黄,边缘不透明,在明胶斜面上发育成黄白色菌苔。
鼠疫菌在Loefflers血清培养基上,发育良好,形成灰白色菌苔而血清不被液化。
在3%食盐琼脂上生长缓慢,细菌呈退行性形态。在远腾培养基上37℃ 24小时后出现红色露滴状菌落,48小时后增大,表面平滑,中心部红色,周边为淡红透明。在麦康凯(Mac-Conkey)琼脂培养基上发育薄弱,此培养基内含胆汁,2~3天后鼠疫菌出现自溶现象。
鼠疫菌在马铃薯培养基上发育不良,22℃ 7天后可见到微弱发育,呈灰白色菌苔。于酸性无蛋白琼脂上发育不良。在牛乳中繁殖力微弱。
新分离的鼠疫菌不形成色素,形成色素是变异的象征,这种现象偶尔在保存时间较久的菌株中可以见到。在培养基中加入氯化血红素,可以形成色素。
在接种过鼠疫菌的陈旧液体或固体培养基中,偶可生成结晶。这是由于鼠疫菌在碱性环境中分解含氮化合物生成氨,与培养基中磷和镁盐结合而形成的磷酸铵镁。此种结晶无色呈屋顶形、信封样或羽毛状,能溶于醋酸中。