第二节 营养素检测
一、水分的测定
水是构成人体的主要组成成分，也是维持人体正常生理活动的重要物质。食物中水分主要以两种形式存在，即自由水（指组织细胞中容易结冰，且能溶解溶质的水）和结合水（以氢键结合的水）。测定食物中水分的方法有干燥法、蒸馏法、卡尔费休法、气相色谱法、微波法及红外吸收光谱法等，选用何种方法则往往根据食物的性质和检验的目的而定。
（一）干燥法
1.直接干燥法
利用水分受热以后，产生的蒸汽压高于空气在烘箱中的分压，使食物中的水分蒸发出来，通过不断加热和排出，达到干燥目的。该法适用于105℃热稳定的各种食物。水果和含糖量较高的食物，不宜在105℃烘干，因为糖，特别是果糖，在高温下（>70℃）易氧化分解。另外对含挥发性成分及含双键的食物也不宜用此法。不同样品的处理、制备方法不同：①固体样品：固体样品先粉碎，过20～40目筛，混匀；②液体样品：液体样品宜先低温浓缩，再高温干燥；③浓稠样品：在测定前，往往加入精制海砂或无水硫酸钠，搅拌均匀，以增大表面积，使测定准确；④水果、蔬菜样品：先洗去泥沙等杂物，再用蒸馏水冲洗一次，最后用纱布和风扇去除附着在菜上的水分，切碎，混匀。
水分测定操作条件的选择要考虑称样重量、称量皿规格、干燥条件等。样品重量一般控制在其干燥的残留物为1.5～3g。玻璃称量皿适用于干燥法，称量皿的规格以样品置于其中平铺后的高度不超过皿高的1/3为宜。干燥温度通常控制在95～105℃。对热较稳定的谷类等，可采用120～130℃。干燥时间的确定有两种方法，一是干燥至恒重，即一样品干燥残留物连续二次干燥放冷称重后，其重量差不大于1～3mg；二是规定干燥时间，指在这个时间内样品中的大部分水分已被除去，以后的干燥处理对结果改变很少。
2.减压干燥法
利用水在低压下沸点降低的原理进行的一种测定方法。它适用于果糖、糖浆、麦乳精、高脂肪食品等。一般来说，减压干燥所需时间长，操作较复杂，所以在一定条件下，直接干燥如能取得与减压干燥相同的测定结果，多数情况下可以不采用减压干燥法。
3.红外线干燥法
利用红外线的辐射热与直射热加热样品，使水分快速蒸发达到干燥，它是一种快速测定方法，一个样品只需10～30分钟，精确度可达到0.1%。
（二）蒸馏法
利用有机溶剂与水产生共沸混合物，然后经过蒸馏，分层，计算食物中水分含量的一种方法。该法设备简便、操作方便、结果准确。适用于谷类、油类、果蔬、香料等食品，特别是香料。蒸馏法是唯一的、公认的测定水分含量的标准方法。常用的有机溶剂为苯或甲苯。
（三）卡尔·费休法
基本原理是利用I2氧化SO2时，需要有定量水的参加。卡尔·费休法除能与水反应外，还能与维生素C、肼衍生物、活性醛、活性酮、过氧化物、金属氧化物等起反应，造成正误差。但是，这些化合物可以在适当的处理条件下进行滴定，消除影响。该法已应用于面粉、砂糖、可可粉、糖蜜、茶叶、炼乳等食品中水分的测定，食品含水量范围可从1ppm到接近100%的样品，结果的准确度优于干燥法。用该法可测定糖果样品中的游离水和结合水。
（四）其他方法
除上述方法外，还有化学干燥法和红外吸收光谱法等，前者适合于对热不稳定及含有易挥发组分的样品如茶叶、香料等，后者可用于谷类、咖啡、花生、腊肉、火腿、牛奶、马铃薯、脱脂乳粉及面包等样品中水分的测定。
（五）水分活度值的测定
水分活度值是表示食品中水分存在的状态，以热力学来表示水的自由度。水分活度（AW）是指在同一条件（温度和压力等）下，食品水分的蒸汽压与纯水蒸气压之比。水分含量与水分活度是两种不同的概念。前者是指食物中水的总含量，而后者则表示食品中水分存在的状态，即水分与食品的结合程度或游离程度。AW值与食品的贮藏性能密切相关。故应用食品水分活度值的大小，作为判断食品易腐败或耐藏的指标。水分活度值的测定方法有AW测定仪法、扩散法和溶剂提取法。
二、脂类的测定
脂肪和类脂总称为脂类，脂肪主要指甘油三酸酯，类脂包括脂肪酸、糖脂、磷脂、甾醇固醇等。食物中脂类往往以两种形式存在，即游离脂类和结合脂类。动物性脂肪及植物性油脂属于游离态，天然存在的磷脂、糖脂、脂蛋白等属于结合脂类。脂类不溶于水，易溶于乙醚、石油醚、氯仿、甲醇等有机溶剂。乙醚溶解脂肪能力比石油醚强，但乙醚可饱和约2%的水分，含水乙醚可抽提出糖分等非脂成分，故实际应用时，必须采用无水乙醚作提取剂，被测样品必须事先干燥。使用石油醚作为提取剂时允许样品含有微量水分。乙醚、石油醚这两种溶剂只能直接提取游离脂肪，不能提取结合脂类。对于结合脂类，则须先用酸或碱进行样品处理，使脂类和非脂成分分离，然后用乙醚或石油醚提取。氯仿-甲醇是另一种有效的提取剂，它对于脂蛋白、磷脂的提取效率较高，特别适用于鱼、肉和家禽的脂肪提取。脂类样品预处理方法决定于样品本身的性质，在样品预处理中，有时需将样品粉碎，有时需将样品烘干，有时需加海砂及无水硫酸钠，其目的是更有效地把脂类提取出来。
食物中脂肪的测定方法有索氏提取法、魏氏酸水解法、罗斯-哥特里法、巴布科克氏法、盖勃氏法和氯仿-甲醇提取法等，选用何种方法要根据食物的种类、脂肪的含量以及存在形式进行选择。
（一）索氏提取法
它是以乙醚或石油醚作为提取剂，用索氏提取器抽提出样品中的脂肪，回收溶剂后所得到的残留物，即为粗脂肪。该法提取出来的脂类主要是游离脂肪，但还含有游离脂肪酸、蜡、色素、磷脂、固醇等脂溶性物质。它适用于脂类含量高、结合脂类含量少，且能烘干磨细，不易吸湿结块的样品。此法为经典方法，结果可靠，但费时，在整个提取过程中应注意防火，切忌用明火加热。
（二）酸水解法
用盐酸水解样品，使其中的结合脂类转变为游离脂类。然后用乙醚和石油醚提取，回收溶剂，干燥、称重，提取物的重量即为脂肪含量。该法适用于各类食物中脂肪的测定，特别是对于易吸湿、结块、难以干燥的样品，应用本法效果较好。但对含有较多磷脂的样品如鱼类、贝类、蛋类，由于盐酸水解时，磷脂几乎完全分解为脂肪酸和碱，致使结果偏低，故对这些样品不宜使用该法。此外对糖含量高的食品，因糖类遇强酸易碳化而影响结果，也不宜用此法。
（三）罗斯-哥特里法
本法适用于各种乳及乳制品的脂肪含量测定，如生乳、牛奶、脱脂乳、炼乳、奶粉、冰激凌等，也适用于豆乳或加水呈乳状的食品，是测定乳类脂肪含量的国际标准法。该法的基本原理是将样品先用氨-乙醇处理，以破坏乳的胶体性状及脂肪球膜，使非脂成分和脂肪分离，然后用乙醚-石油醚提取，去除溶剂后，残留物即为乳脂。
（四）巴布科克法和盖勃氏法
利用硫酸溶解乳中的乳糖和蛋白质等非脂成分，使脂肪球膜破坏，脂肪游离，然后加热、离心、分离脂肪，直接读取脂肪层，计算出被测乳的含脂率。适用于鲜乳和乳制品。不宜用于含糖量高的甜炼乳，因硫酸处理时糖易焦化，结果误差较大。由巴布科克法和盖勃氏法所测得的脂肪中，不包含有磷脂，故对高含量磷脂的乳样品（如酪乳、磷脂含量可高达24%），不宜用此法。操作过程中，硫酸的浓度及用量应严格遵守方法中规定的要求。
（五）氯仿-甲醇提取法
当存在一定水分时，氯仿-甲醇混合液能有效地提取结合脂类。特别适合于含磷脂量高的样品，如鱼、肉、禽、蛋等。该法对于高水分样品脂类的测定更为有效。对于干燥样品，可先在样品中加入一定量水分，使组织膨润，再进行提取。
脂肪含量测定除以上介绍的几种方法以外，还有比重法、折光法、磁共振法、红外分光光度法及自动乳成分综合测定仪法等。
（六）气相色谱法
食物中脂肪酸的测定方法现多使用气相色谱法。样品经甲醇和氯仿提取后，用甲醇-浓硫酸加热回流酯化，生成脂肪酸甲酯，利用各气体组分在载气和固定液膜的气液两相中的分配系数不同，以达到各种脂肪酸的分离，然后进行分别测定。如动物肝脂的分析，目前多采用填充柱分离多种饱和及非饱和脂肪酸，但毛细管色谱柱分离效果更佳。
（七）比色法
食物中胆固醇的测定仍采用比色法，利用胆固醇与酸作用，经脱水、聚合反应，生成绿色物质（双胆甾二烯单磺酸）或紫色物质（双胆甾二烯磺酸），再进行比色测定。样品预处理：肉类洗涤后，用净布擦干，绞肉机绞细；鱼类洗净后，擦干称重，去除鳞、头部、内脏蒸熟，去鱼刺，最后将去刺的熟鱼肉和汤水一起搅匀备用；蛋类洗净后，蒸熟，去壳，将蛋黄和蛋白分开，备用。食物脂肪的提取，一般用研磨浸提法或匀浆器法提取，乳类则用罗斯-哥特里法提取。本法测定食物胆固醇的平均偏差为0.29%，回收率为95%～106%。
三、碳水化合物分析
碳水化合物是由碳、氢、氧组成的有机化合物，广泛分布于谷类食物、水果、蔬菜及作为各种食品的原辅料，是许多食品的主要成分之一。在食物成分表中，食物中碳水化合物的含量是通过减差法计算而来的，即碳水化合物=100-（水分+粗蛋白质+粗脂肪+膳食纤维+灰分）。碳水化合物在食品中存在形式和含量不一，它包括单糖、低聚糖和多糖。单糖是指用水解法不能加以分解的碳水化合物，是糖类的最基本组成单位，主要有葡萄糖、果糖和半乳糖，它们均含有6个碳原子的多羟基醛（葡萄糖、半乳糖）或多羟基酮（果糖）。低聚糖包括双糖和三糖，双糖主要有蔗糖、乳糖和麦芽糖，三糖有棉子糖等。凡具有光合作用的植物都含蔗糖，而乳糖只存在于哺乳动物的乳汁中。多糖是由许多单糖缩合而成的高分子化合物，主要有淀粉、糖原、纤维素、果胶。
测定食物中碳水化合物的方法很多，有物理法、化学法、色谱法和酶法。在常规分析中，食物中还原糖、蔗糖、总糖的测定以化学法应用最广，但用化学法只能测出糖的总量，不能确定糖的种类和每种糖的含量。对于食物中各种糖的分离和定量可用纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法及高效液相色谱法。多糖、淀粉的测定通常采用先水解，使之成为单糖，然后用测定单糖的方法加以分析。
（一）单糖和低聚糖提取液的制备
1.对于脂肪含量比较高的物品，如巧克力、乳酪等，须先脱脂，然后用水提取。
2.对于含淀粉和糊精高的样品，如粮谷及其制品、调味品等，一般用70%～75%乙醇溶液提取，使淀粉、糊精及蛋白质沉淀析出，防止干扰。
3.对于固体样品，用水提取，温度一般在40～50℃，最高不超过80℃。
4.提取液的糖含量一般控制在0.5～3.5mg/ml。
（二）提取液的澄清
以上提取液中，除含有待测物质之外，还含有一些干扰物质，如色素、蛋白质、有机酸、氨基酸、可溶性淀粉等。这些干扰物质的存在常给分析结果带来影响，因此必须除去，其去除方法是加入澄清剂。常用澄清剂有：
1.中性醋酸铅
能去除提取液中蛋白质、有机酸、单宁、果胶等，且不沉淀还原糖，但脱色效果较差。
2.醋酸锌和亚铁氰化钾溶液
去除蛋白质能力较强，但脱色效果差，适用于乳制品等蛋白质含量较高，色浅的样品。
3.活性炭
脱色效果较好，但在脱色过程中，伴随着糖的较大损失。澄清剂的用量必须适当。过量的澄清剂要去除，如以中性醋酸铅作澄清剂时，过量的铅能与果糖生成铅糖化合物，使结果偏低。常用的除铅剂为草酸钠、硫酸钠等。
（三）还原性糖测定
还原性糖是指分子结构中具有游离醛基、游离酮基和游离半缩醛羟基的单糖和双糖，如葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖。蔗糖、糊精、淀粉等为非还原性糖，经水解后生成还原性糖，然后测其含量。还原性糖的测定方法有直接滴定法、高锰酸钾法、萨氏法、兰-埃农法和碘量法等。前两个方法是国家标准分析方法，适用于各类食品中还原性糖的测定。
1.直接滴定法
直接滴定法是在加热条件下，以亚甲基蓝为指示剂，使还原糖与酒石酸钾钠铜反应生成氧化亚铜沉淀，过量的还原糖把亚甲基蓝还原，指示终点。该法快速、简单，适合于各类食品中还原糖的测定，不宜用于深色食品如酱油、深色果汁等检测，以免终点难以确定，影响准确性。要注意的是，在滴定过程中必须在沸腾条件下进行。
2.高锰酸钾法
高锰酸钾法是将样品试液与过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖把二价铜还原为氧化亚铜，然后于氧化亚铜沉淀中，加入过量的酸性硫酸铁，三价铁被定量地还原为二价铁，然后用高锰酸钾滴定亚铁，最后从检索表中查出还原糖量。该法准确度高，重现性好，且不受颜色影响，但操作比较麻烦。样品处理时，不可使用醋酸锌和亚铁氰化钾作为澄清剂，以免二价铁掺入。样品中含有麦芽糖、乳糖时，测定结果将偏低。
3.萨氏法
萨氏法是将样品试液与碱性铜盐溶液加热，使产生的氧化亚铜溶于酸，然后用碘化物-硫代硫酸钠滴定法测定铜量，从而计算出样品中还原糖的含量。该法用于生物材料或经层析处理后的微量样品，检出量为0.015～3mg，结果可靠。
4.兰-埃农法
兰-埃农法的分析原理同直接滴定法，许多国家把此法作为还原糖测定的标准分析方法。适用于测定转化糖含量在0.3%～30%的上等白糖、中等白糖及糖蜜等，蜂蜜、饴糖、果子酱、糖浆、饼干等焙烧点心，以及加糖的馅、羊羹等糕点。
5.碘量法
碘量法的基本原理是碘在氢氧化钠溶液中生成次碘酸钠，次碘酸钠把醛糖氧化为醛糖酸钠，酸化后，析出的碘用硫代硫酸钠滴定即可求得醛糖含量。本法适用于硬糖、异构糖、果汁等样品中葡萄糖的测定，亦可用于醛糖和酮糖同时存在时单独测定醛糖。
（四）非还原性糖测定
蔗糖是由葡萄糖和果糖组成的非还原性糖，不能直接用以上方法测定，但在一定条件下，蔗糖经酸或酶水解生成具有还原性的葡萄糖和果糖混合物（转化糖），然后测定转化糖，即可定量蔗糖。常用6mmol/L盐酸水解蔗糖，使之转化为还原糖，然后测定，所得结果乘以0.95，即为蔗糖含量。
（五）总糖的测定
总糖是指食物中含有还原性糖和在测定条件下能水解为还原性糖的总糖量。方法有直接滴定法、苯酚-硫酸法、蒽酮比色法等。
（六）各种糖测定
除以上介绍测定食品中的糖的总量外，往往还要同时对各种糖进行分别定量。糖类的分离定量及其组成的分析一般采用色谱法。
1.纸层析法和薄层层析法
可分离不同类型的糖如己糖、戊糖等，但对结构类似的糖分离效果不好且费时。一般来说，糖类的Rf值为单糖>二糖>三糖，戊糖>己糖，酮糖>醛糖。
2.气相色谱法
把糖制成三氯硅烷衍生物和三氟乙酰衍生物能获得较满意的分离效果，且能分离异构体。此法适用于水果、蔬菜及其制品，不宜用于含乳糖的乳制品。对于脂肪含量高的样品，先用正己烷脱脂，而对于淀粉含量较高的样品，宜用80%乙醇提取。
3.高效液相色谱法
使用μBondapak液相色谱柱，以乙腈和水作为流动相，由差示折射检测器定量测定。适用于水果、蔬菜、乳及乳制品、谷类及其他富含淀粉样品的糖测定，但对各类食物的样品预处理均不同。该法已广泛地用于多种食品中糖的测定。
（七）多糖的测定
淀粉、纤维素和果胶均为多糖。淀粉和纤维素的基本单位为葡萄糖，前者是由葡萄糖残基通过α-1，4或α-1，6-糖苷键结合构成，后者则是通过β-1，4-糖苷键结合而成，果胶的基本结构是半乳糖醛酸，以α-1，4糖苷键结合形成的聚半乳糖醛酸。
1.淀粉测定
根据葡萄糖单位结合形式的不同、淀粉分为直链淀粉和支链淀粉。直链淀粉不溶于冷水，能溶于热水，与碘生成稳定的络合物；支链淀粉只在加热并加压的条件下才能溶解于水，与碘形成的络合物，不稳定。淀粉的水溶液呈右旋性，可被酸水解为葡萄糖，也可被酶水解生成麦芽糖和糊精，再经酸水解为葡萄糖。淀粉的检测方法均是根据它的理化性质而建立的。
（1）酸水解法：
样品经处理，用酸水解淀粉使之转化为葡萄糖，按照测定还原性糖的方法定量，再折算为淀粉。酸水解法适用于淀粉含量较高的食品如粮食、糕点、饼干、代乳糖等，不宜用于富含半纤维素、果胶的试样，以免测定结果偏高。还原糖换算为淀粉含量时要乘上换算系数0.9。
（2）酶水解法：
淀粉经糊化后，在淀粉酶的作用下，水解为麦芽糖和糊精，再用酸水解为葡萄糖，按测定还原性糖方法定量，所得结果乘上0.9，即为淀粉含量。由于淀粉酶具有专一性，只水解淀粉，故特别适用于含半纤维素、果胶等非淀粉的多糖类，结果准确性高于酸水解法，但费时。高脂肪会妨碍酶对淀粉的作用，因此样品应先脱脂。
（3）肉类制品中淀粉含量的测定：
用氢氧化钾醇溶液处理样品，使脂肪和蛋白质溶解，而淀粉则生成醇不溶性络合物，分离淀粉，然后用重量法测定。该法适用于富含脂肪和蛋白质的样品如午餐肉、香肠等食品，但不宜用于其他多糖含量较多的植物样品。对于蔬菜、水果等淀粉含量较少的样品，一般是在高压下，用硫酸水解，使淀粉水解为葡萄糖，然后测定水解液的糖量。
2.膳食纤维测定
粗纤维是指食物中不能被稀酸、稀碱溶解，不被人体所消化和吸收的物质，主要成分为纤维素和木质素，粗纤维不能代表食品中纤维的全部内容。膳食纤维是指不被人体消化酶所消化、分解、吸收的物质，包括纤维素、半纤维素、木质素、角质、二氧化硅、果胶等。
（1）粗纤维测定：
脱脂试样经用煮沸的酸及碱溶液处理后，除去糖、淀粉、果胶及蛋白质，所得的残渣称为粗纤维。该法为经典法，适用于各类食品，但结果比较粗糙，测得值与实际含量差别较大。影响结果准确性的主要因素：①样品的细度影响结果，颗粒越粗，结果越高，颗粒越细，结果越低，一般控制在1mm左右；②加酸加碱处理的时间要严格掌握。
（2）中性洗涤纤维的测定：
样品经中性洗涤剂煮沸消化后，剩余的残渣加入α-淀粉酶溶液，以水解除去淀粉。然后用水及丙酮洗涤残渣，去除脂肪、色素等，残渣经烘干，称重即为中性洗涤纤维。结果包括纤维素、半纤维素、木质素和角质等，最接近于食物中膳食纤维的真实含量。用本法测出的膳食纤维含有部分灰分，但不包括水溶性多糖。我国食物成分表中的膳食纤维即用此法测定。该法适用于谷类、果蔬等植物性样品，测定结果高于粗纤维测定值。缺点是对蛋白质、淀粉含量高的试样，易起泡或过滤困难，这使该法使用受到一定限制。
（3）酸性洗涤纤维测定：
酸性洗涤纤维包括样品中全部纤维素、木质素及部分无机盐，测得结果高于粗纤维测定值，但低于中性洗涤剂方法测定值，也比较接近食品中膳食纤维的含量。其基本原理是用十六烷基三甲基溴化铵的硫酸溶液煮沸处理，经过滤、洗涤、烘干，所得残留物即为酸性洗涤纤维，适用于各类食物中膳食纤维的测定。
（4）果胶物质的测定：
果胶物质是复杂的高分子聚合物，其基本结构是半乳糖醛酸以α-1，4-糖苷键聚合形成的聚半乳糖醛酸。测定方法有重量法和比色法等，重量法是将样品先用70%乙醇处理，析出果胶沉淀后，用乙醇、乙醚洗涤，除去杂质，再用酸或水提取总果胶物质或水溶性果胶物质。提取出来的果胶经皂化、酸化、加钙，使之生成果胶酸钙沉淀，然后烘干沉淀，称重，即可算出试样中果胶的含量。比色法是基于果胶水解后生成半乳糖醛酸，而生成的半乳糖醛酸在强酸性溶液中与卡唑发生缩合反应，生成紫红色化合物，从而比色定量。实验中糖分的存在对卡唑呈色反应影响较大，使测定结果偏高，故样品处理时应尽量洗涤除去糖分。以上两种方法均适合于各类食品中果胶物质的测定。
四、蛋白质分析
蛋白质是复杂的高分子化合物，由氨基酸以肽键形式相互连接而成，分子量大，可高达数百万甚至数千万。所含的主要元素为碳、氢、氧、氮和硫。有些蛋白质还含有微量的磷、铜、铁、碘等。蛋白质经酶、酸或碱水解，其水解的中间产物为胨和肽，最终产物为氨基酸。蛋白质的分离和纯化是根据蛋白质溶解度不同、分子大小不同、带电性及配体特异性等性质进行的。而蛋白质的分析方法则是基于它的共性（含氮量、肽键、折射率等）及特定氨基酸残基、酸性、碱性基团和芳香基团而设计的。常用的方法有凯氏定氮法、双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法及酚试剂法等。
（一）常量凯氏定氮法
凯氏定氮法于1833年由Kieldahl提出后，经不断改良，一直沿用至今，是测定食物中蛋白质含量的标准分析方法，它以蛋白质氮平均含量为16%作为依据（即1g氮≈6.25g蛋白质，此数值称为蛋白质换算系数），通过测定样品中的总氮量再乘以蛋白质的换算系数，进而求出蛋白质含量。由于食物样品还含有一些非蛋白氮、如酰胺氮、嘌呤氮等，故测得的蛋白质称为粗蛋白质。该法的基本原理是用强酸加催化剂消化样品，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵，留在溶液中，然后加碱蒸馏，用硼酸吸收蒸馏出来的氨，最后用盐酸滴定，从而计算出蛋白质含量。此法适用于各类食物中蛋白质含量测定。凯氏定氮法中的催化剂有硫酸铜、氧化汞和汞、硒粉等，其中以硫酸铜为最常用。硫酸铜在实验中除作为催化剂外，还可用作指示剂。在整个实验操作中要注意以下几个问题：对含脂肪和糖较多的样品，消化时易起泡，为防止泡沫溢出，在开始消化时应用小火加热，或加入辛醇或硅油消泡剂。当样品中含赖氨酸、组氨酸、酪氨酸等较多时，应适当延长时间，使有机物完全分解，否则结果偏低。加碱后，瓶内溶液不变成深蓝色、棕色或黑色沉淀，应补加氢氧化钠量。蒸馏过程中要注意接头无松漏现象。蒸馏完毕后，应先将吸收瓶离开冷凝管，再继续蒸馏1分钟，后关掉热源，以免造成吸收液倒吸。如样品消化液不易澄清，可将凯氏瓶冷却，然后加入30%过氧化氢2～3ml，再继续加热消化。
（二）微量凯氏定氮法
此法消化原理和操作步骤与常量凯氏定氮法基本一致，只是取样量、试剂用量减少，另需一套微量凯氏定氮蒸馏装置。
（三）双缩脲法
蛋白质分子中含有肽键，与双缩脲结构类似，故也能在碱性条件下，与硫酸铜作用生成红紫色络合物，从而进行定量。该法的特点是：不同种类的蛋白质，发色程度影响不大；当脯氨酸与多量糖类共存时，呈色反应不好，结果偏低。高脂肪样品应先脱脂。此法适用于豆类、油料及肉类等样品的蛋白质的测定。本法缺点是灵敏度较低，但优点是操作简单快速。
（四）紫外分光光度法
利用芳香族氨基酸在280nm处对紫外线有最大吸收的原理而进行测定的方法。线性范围：蛋白质浓度3～8mg/ml。该法操作简单、快速，所需样品量少，缺点是许多非蛋白质均会干扰，此法适用于牛奶、小麦面粉、糕点、豆类、蛋黄及肉制品中的蛋白质含量。
（五）染料结合法
染料测定法分为测定结合染料或剩余染料，食物分析中常使用测定剩余染料，该方法的基本原理是在一定条件下，加入过量的染料，使其和蛋白质结合生成沉淀，然后用分光法测定未反应的染料，进而算出蛋白质含量，不同染料用于不同的样品，如酸性橙红12可用于牛奶、冰激凌、巧克力、脱脂乳粉。橙黄G用于谷类、牛奶、鱼粉、大豆及花生；胺黑10B用于乳制品；溴酚蓝用于蜂蜜等。该法需要一定的经验，故操作方法必须规范化。
五、氨基酸的分析
食物中氨基酸主要以构成蛋白质的氨基酸和游离氨基酸的形式存在。由于食物中氨基酸成分的复杂性，在常规检验中一般用化学法测定样品中的氨基酸总量。对于各种氨基酸的分离分析，过去采用微生物法和纸层析法，现多采用氨基酸自动分析法、高效液相色谱法、气相色谱法等。
（一）氨基酸总量测定
1.双指示剂甲醛滴定法
氨基酸既含有酸性的—COOH基，也含有碱性的—NH2基，它们互相作用使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，—NH2基与甲醛结合，使碱性消失，接下来可用碱来滴定—COOH，测出氨基酸的总量。该法简单、快速，适用于食品中游离氨基酸的测定。液体试样不需处理，可直接测定，固体试样应先粉碎，用水萃取，再行测定。对颜色较深的样品，应加活性炭脱色后再分析，所用的指示剂为百里酚酞和中性红。
2.茚三酮比色法
氨基酸在一定的pH条件下，与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物，于570nm处比色定量。茚三酮受阳光、湿度、空气、温度等影响易被氧化而呈淡红色或深红色，使用前往往需要进行纯化。
（二）氨基酸的分离与测定
1.薄层层析法
将经水解后的样液滴加在薄板上，在溶剂系统中用双向上行法展开，由于各种氨基酸的吸附能力和Rf值不同而达到彼此分离的目的。然后用茚三酮溶液显色，与标准氨基酸的位置比较可鉴定样液中各种氨基酸的种类，从斑点颜色的深浅可大致确定含量。盐酸水解液的浓度为5.7N，碱向展开剂为叔丁醇-甲乙酮-氢氧化铵-水（5∶3∶1∶1，V/V），酸向展开剂为异丙醇 -甲酸 -水溶液（20∶1∶5，V/V）。
2.气相色谱法
将氨基酸转变为适合于气相色谱分析的衍生物三氟乙酰基正丁酯，包括正丁醇的酯化和三氟醋酸酐的酰化。然后将氨基酸衍生物进行气相分析。根据它们的保留时间与标样比较后加以定性，氨基酸出峰顺序为丙氨酸、缬氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丝氨酸、蛋氨酸、羟脯氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸和胱氨酸。
3.氨基酸自动分析仪法
食物蛋白质经盐酸作用，水解为游离氨基酸，然后用氨基酸自动分析仪分析。分离原理是利用各种氨基酸的酸碱性、极性和分子量大小不同等性质，使用阳离子交换树脂在层析柱上进行层析，应用不同pH和离子浓度的缓冲液洗脱样品时，各种氨基酸将被依次洗脱分离。出峰次序为酸性氨基酸和极性较大的氨基酸，其次为非极性和芳香族氨基酸，最后为碱性氨基酸。被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应，从而进行定性、定量。测定游离氨基酸时，需将样品去蛋白质后，再进行分析。分析组成蛋白质的各种氨基酸时，需将样品水解，使蛋白质完全变为游离氨基酸后才能上机分析。酸处理方法：称取样品（蛋白含量在10～20mg），用6N HCl于110℃水解24小时，然后除去盐酸，加缓冲液稀释并定容到一定体积，上机。当样品中含脂肪、核酸、无机盐等杂质时，必须先去除杂质后再进行酸水解。必须指出的是，用盐酸水解蛋白质的过程中，色氨酸极易被分解，胱氨酸、半胱氨酸也易被破坏。测定此类物质时，应改用碱水解法或过甲酸氧化法处理。氨基酸的分离及测定亦可用气相色谱及反相高效液相色谱法。
4.色氨酸的测定
用氢氧化钠水解蛋白质，直接测定色氨酸的天然荧光，在水解液中只有色氨酸和酪氨酸可被检测到荧光。在4mol尿素溶液中（pH11），色氨酸的荧光强度比酪氨酸大100倍，且二者荧光峰相差40nm多。利用此特点，可在大量酪氨酸存在时，直接测定色氨酸含量。该方法适用于各类食物中色氨酸的测定。
六、维生素的测定
食物中含有的维生素、种类很多，功能多种多样，化学结构差异很大，有的属于醇类（如维生素A），有的属于醛类（如维生素B6），有的属于胺类（如维生素B1），还有的属于酚或醌类。目前均根据其溶解度把它们分为脂溶性维生素和水溶性维生素。前者包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等，后者包括维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、尼克酸、叶酸、胆碱等。
维生素的分析方法有紫外分光法、荧光法、动物学法及微生物法等。紫外分光法、荧光法是多种维生素的标准分析方法，各种色谱法在维生素分析中占有很重要的地位，特别是高压液相色谱法，可同时进行多种维生素及其异构体的分离检测。选用何种方法应根据样品的种类，待检维生素的性质、含量，以及干扰物多少等因素来决定，其分析的一般程序是：①用酸、碱或酶分解样品，使维生素游离；②用适当溶剂提取；③分离干扰物质，对样液进行分离提纯；④用适当方法定量。
（一）脂溶性维生素的测定
1.维生素A的测定
维生素A是一个带有两个异戊二烯单位的β-紫罗酮环。溶于脂肪、乙醚、氯仿等有机溶剂，不溶于水。对酸不稳定，而对碱稳定，易氧化，光和热促使其氧化。维生素A的测量方法有比色法、紫外分光光度法、荧光法及高效液相色谱法。比色法适用于维生素A含量高的样品，紫外法、荧光法或高效液相色谱法用于低含量的维生素A样品，如每克样品中含5～10μg维生素A。
（1）三氯化锑比色法：
将一定量的试样，在乙醇中用氢氧化钾皂化，用苯或乙醚将维生素A与其他不皂化物同时提取出来，然后根据维生素A在氯仿溶液中与三氯化锑形成蓝色物质，在620nm处测定。此法适用于维生素A含量较高的各种食品。结果准确，为国家标准分析方法，缺点是显色后很快褪色，比色必须在6秒钟内完成。整个操作过程应避光进行。三氯化锑腐蚀性很强，不能沾在手上。三氯化锑能与水生成白色沉淀，所以不能碰到水，用过的仪器须先用稀盐酸浸泡后再洗涤。
（2）紫外分光光度法：
维生素A的异丙醇溶液在328nm波长下，对光有一最大吸收，其吸收度与维生素A的量成正比，适用于透明的鱼油和其他含有维生素A的浓缩物。对于一般样品，则必须要先将样品皂化，再经柱层析去除干扰物，然后测定。
（3）高效液相色谱法：
本法能分离分析视黄醇和它的同分异构体、酯及其衍生物，高效液相色谱法同时测定维生素A和维生素E，已被列入国家标准，其相对偏差为≤10%。
2.β-胡萝卜素的测定
胡萝卜素溶于有机溶剂，对热、酸及碱比较稳定，但紫外线和空气中的氧可促使其氧化破坏，植物体内胡萝卜素常与叶黄素、叶绿素等共存。测定β-胡萝卜素的国家标准方法是纸层析法，即样品先用丙酮和石油醚提取，以石油醚为展开剂进行纸层析分离，然后于450nm处比色。此法适用于粮食、蔬菜与其他植物性食物，最小检出限为0.11μg。
3.维生素D的测定
维生素D不溶于水，易溶于有机溶剂，比维生素A稳定。食物中维生素D的含量很少，主要存在于动物性食品中。三氯化锑比色法和高效液相色谱法是测定维生素D的较好方法。用三氯化锑比色法测定维生素D时，维生素A、维生素E和固醇类均有干扰，故在测定前必须经层析去除。操作中加入乙酰氯可消除温度、湿度等干扰因素。一般使用二级高效液相色谱法分离分析维生素D。
4.维生素E的测定
维生素E不溶于水，溶于有机溶剂，不会被酸碱氢化过程及高温破坏，但易氧化，是一种抗氧化剂。食品中维生素E的测定方法有比色法、荧光法和高效液相色谱法。比色法测定维生素E的基本原理是维生素E能将三价铁离子还原为二价铁离子，利用二价铁离子与2，2-联氮苯的颜色反应来定量，结果为维生素E总量。整个实验应避光。荧光法测定维生素E（激发光295nm、发射324nm）特异性较强，且简单快速，对α-维生素E含量高的样品（如动物组织、脏器等），用本法测得值与样品中总维生素E的真实含量比较接近。高效液相色谱法能分离维生素E异构体，分辨率高。
（二）水溶性维生素测定
水溶性维生素在酸性溶液中稳定，即使加热也不破坏，但在碱性溶液中不稳定，易分解。空气、热、光、金属离子等均影响维生素的稳定性。维生素B2、维生素B6对光敏感，易被分解破坏；维生素C易被氧化，特别是在碱性溶液中和铜离子存在的情况下；而尼克酸是最稳定的维生素。水溶性维生素的样品预处理，一般在酸性溶液中进行，根据样品情况用淀粉酶和蛋白酶进行酶解，使结合态维生素游离出来，再进行提取、去杂质等，最后定量。
1.维生素B1测定
维生素B1以游离态或以焦磷酸酯形式存在于食物中，以米糠、酵母、麦胚中含量为高，维生素B1的测定常用荧光法。该法的基本原理是在碱性铁氰化钾溶液中，维生素B1能被氧化成硫色素，在紫外光下，发生蓝色荧光，在不存在其他荧光物质时，荧光强度与硫色素浓度成正比。实验中要注意以下几点：①谷类食物不需酶解，样品经粉碎后可直接用25%酸性氯化钾提取。淀粉和蛋白质含量高的食物则采用酸和酶处理；②硫色素在酸性氯化钾，正丁醇溶液中稳定。但对紫外线敏感，易被破坏；③样品中所含杂质较多时，应经过层析处理，再行测定。
2.维生素B2测定
维生素B2以游离形式或磷酸酯等形式存在于食物中。在肝、肾、心、蛋、奶、新鲜绿叶蔬菜中含量较高。常用荧光法和微生物法测定食物中维生素B2含量。荧光法即样品先用酸和酶解处理，使维生素B2游离，用高锰酸钾和过氧化氢氧化去除杂质和色素，再经硅镁吸附剂层析，被吸附的维生素B2，用丙酮、冰乙酸、水洗脱，然后于440nm激发光和525nm发射光下测定，适用于各类食物中维生素B2的测定。但用本法测定维生素B2含量低的样品时，其结果与微生物法比较有偏高或偏低的现象。微生物法测定维生素B2是基于酪乳酸杆菌在一定的培养基及生长条件下，其代谢产物乳酸的生成量与培养基中的维生素B2浓度成正比的原理而设计的一种方法。样品经酸和酶水解释放出游离的维生素B2。将一定浓度的待测溶液与培养基共同高压灭菌后，接种酪乳酸杆菌菌种，于37℃培养数小时，然后用0.1N氢氧化钠溶液滴定乳酸的含量，由标准曲线计算维生素B2的含量，此法准确，但费时。
3.尼克酸测定
尼克酸在动物组织中一般以烟酰胺形式存在，而在植物组织中以尼克酸形式存在，肝、肾、瘦肉、禽肉、玉米、花生等含量较丰富。它是B族维生素中最稳定的维生素，不被光、热、碱、酸或氧所破坏。测定方法为微生物法和化学法。微生物法利用阿拉伯乳酸杆菌在生长过程中必须有尼克酸存在的原理，根据它的生长代谢产物乳酸的产量来测定检测样品中尼克酸及尼克酰胺的含量。样品用1当量硫酸处理，使尼克酸游离，然后按微生物常规操作进行测定。化学方法是利用尼克酸与溴化氰结合后可与芳香族胺类化合物产生黄色物质的现象，根据黄色深浅可定量样品中尼克酸的含量。另外，高效液相色谱法也可用于测定尼克酸及尼克酰胺的含量。
4.维生素C的测定
维生素C是一种己糖醛酸，广泛存在于植物组织中，在鲜枣、猕猴桃、辣椒、柑橘中含量丰富。食物中维生素C以抗坏血酸、脱氢抗坏血酸和2，3-二酮古乐糖酸形式存在，前两种形式具有生理活性，而后者无生理效应。分析方法有2，6-二氯靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法及高效液相色谱法。
（1）2，6-二氯靛酚滴定法：
该法基本原理是还原型抗坏血酸能还原染料2，6-二氯酚靛酚。该染料在酸性条件下呈红色，被还原后颜色消失。还原型抗坏血酸还原2，6-二氯酚靛酚后，本身被氧化为脱氢抗坏血酸。在没有其他杂质干扰下，一定量的试样提取液还原标准染料溶液的量与样品中所含抗坏血酸的量成正比。操作时应注意取样后应浸泡在已知量的2%草酸溶液中，以防氧化损失。该方法简单易操作，但特异性差，干扰物多，结果往往偏高。此外，它测定的是还原型的抗坏血酸。
（2）2，4-二硝基苯肼比色法：
样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用生成红色脎，根据脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸量成正比，进行比色定量。该法测得的是总抗坏血酸的含量，即包括抗坏血酸、脱氢抗坏血酸和二酮古乐糖酸。适合于蔬菜、水果及其制品总抗坏血酸含量的测定。
（3）荧光法：
用活性炭将样品中还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，再与邻苯二胺反应生成有荧光的喹喔啉。在一定条件下，其荧光强度与脱氢抗坏血酸浓度成正比，从而进行比色定量。本法测得结果包括抗坏血酸和脱氢抗坏血酸。如果样品中存在丙酮酸时，也与邻苯二胺作用生成一种引起干扰的荧光物质，这时可加入硼酸处理。由于脱氢抗坏酸与硼酸结合形成复合物，此复合物不再与邻苯二胺产生荧光物质。而丙酮酸则不能与硼酸结合。利用此特点可排除样品中荧光杂质产生的干扰。该法最低检出为0.02μg/ml，结果准确度较高，重复性好，但操作较麻烦，适合于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量的测定。
此外，高效液相色谱法可同时分别测定抗坏血酸和脱氢抗坏血酸，具有准确度高、重现性好、灵敏等优点，是目前最先进、最可靠的测定方法。食物中维生素C的提取常用草酸、偏磷酸、偏磷酸-乙酸或三氯醋酸等试剂。
5.维生素B6的测定
维生素B6包括吡哆醇、吡哆醛及吡哆胺。吡哆醇大量存在于蔬菜产品中，而吡哆醛和吡哆胺则主要存在于动物产品内，在酸碱性溶液中对热稳定，但易受氧化剂（如HNO3、KMnO4、H2O2等）破坏，测定方法有荧光法、气相色谱法及高效液相色谱法。荧光法是样品经硫酸加压水解，用CGS树脂的柱层析分离，以氯化钾的磷酸缓冲溶液洗脱，在二氧化锰和乙醛酸钠存在下，使吡哆醇和吡哆胺全部转化为吡哆醛，然后与氰化钾作用生成荧光物质吡哆醛氰醇衍生物，测定其荧光强度，计算出维生素B6的总量。本法测定浓度范围为0.03～0.15μg/ml，气相色谱法和高效液相色谱法可分别测定吡哆醇、吡哆醛和吡哆胺。
6.叶酸测定
食物中叶酸绝大部分是以蝶酰多谷氨酸形式存在。在中性或碱性溶液中对热稳定，测定方法有荧光法及微生物法等，荧光法是利用叶酸中吡嗪-嘧啶环，在紫外光照射下产生蓝色荧光这一性质定量的，常用偏磷酸热提样品中的叶酸。
七、无机元素测定
食物中的无机元素，通常与有机物质结合存在于食物中。在分析前，必须先使有机物质分解，释放出被测成分，然后进一步通过分离、浓缩，去除干扰元素和富集被测元素，再根据待测元素在食物中的大概含量和客观条件选择分析方法。无机元素的分解方法常用干法灰化和湿法消化，分离和富集的方法一般用离子交换法和螯合溶剂萃取法，测定方法主要有比色法、原子吸收分光光度法、荧光法及离子选择性电极法等。比色法由于简单、灵敏，尽管操作较麻烦，但一直被广泛使用。原子吸收分光光度法的应用，使无机元素的分析进入一个新的阶段，该法因灵敏度高，精密度高，选择性好，操作简便，测样品多以及快速等特点，已被广泛应用于食品中无机元素的测定。
（一）钙测定
1.高锰酸钾法
样品灰化后在氨性或中性溶液中使钙与草酸作用，生成草酸钙沉淀，然后用硫酸溶解，高锰酸钾标准液滴定，根据高锰酸钾标准液的消耗量，即可算出钙的含量，该法可测定钙含量在几个mg/100g以上的食品。
2.EDTA滴定法
这是根据Ca2+与EDTA在pH12～14条件下生成稳定的EDTA-Ca2+络合物的原理而设计的一种测定方法。溶液中的锌、铜、镍和钴会产生干扰，可加入KCN加以掩蔽，铁可用枸橼酸钠掩蔽。本方法的检测范围为5～50μg。适用于各类食物中钙的测定。
（二）铁测定
食物中铁的测定常用硫氰酸盐比色法、邻菲罗啉比色法和原子吸收分光光度法。
1.硫氰酸钾比色法
反应的基本原理是在酸性条件下，铁离子与硫氰酸钾作用生成血红色的硫氰酸铁络合物，该溶液颜色的深浅与铁离子的浓度成正比，从而进行比色定量。实验中加入的过硫酸钾是为了防止三价铁转变为二价铁。由于生成的硫氰酸铁有色络合物稳定性比较差，因此应在规定时间内完成比色。
2.邻菲罗啉比色法
样品经灰化、溶解，在酸性条件下把三价铁离子转变成二价铁离子，然后与邻菲罗啉作用生成红色络合物于510nm处比色。本法选择性高，显色稳定，灵敏度和精密度较高。
（三）锌的测定
常用方法有双硫腙比色法和原子吸收分光光度法。双硫腙比色法是样品经消化后，在pH4.5～5.5时，锌离子与双硫腙生成红色络合物。溶于四氯化碳，加入硫代硫酸钠、盐酸羟胺溶液，防止其他金属离子的干扰，从而进行定量。反应中加入硫代硫酸钠可去除铜、汞、铅镉和铋等的干扰，柠檬酸则可掩蔽铁与铅，是公认的最灵敏的方法之一。
（四）铜的测定
测铜方法有二乙胺基二硫代甲酸钠比色法和原子吸收法，前者反应的基本原理为，样品经消化后，在氨碱性溶液中，铜离子与二乙胺基二硫代甲酸钠作用，生成棕黄色络合物，溶于四氯化碳，于440nm处测定。食物中铁含量超过铜的50倍时会产生干扰，这时可加入EDTA或柠檬酸铵试剂予以掩蔽，测铜最适宜浓度为1μg/ml。
（五）铬测定
微量铬的测定一般用二苯碳酰二肼比色法和原子吸收分光光度法。二苯碳酰二肼比色法的基本原理是样品经消化后，用高锰酸钾氧化铬使其全部生成六价铬，在酸性条件下与二苯基碳酰二肼作用生成紫红色络合物，颜色的深浅与铬含量成正比。实验中所用玻璃器皿不能用重铬酸钾洗液浸泡，铬与二苯基碳酰二肼作用的最适pH是硫酸酸度为0.2N。含铁高的样品溶液会使铬的测定结果偏低，此法线性范围为0.2～10μg。原子吸收分光光度法见后。
（六）锰的测定
一般用过硫酸铵比色法定量，该法的基本原理是在硝酸银存在下，过硫酸铵把可溶性的锰化合物氧化成高锰酸盐而呈紫红色，颜色的深浅与样品中锰含量成正比，再进行比色定量。实验中锰试剂不能在煮沸时加入，以防作用剧烈而溢出。含氯化钠的食品在测定锰前应先加硝酸银，使之生成氯化银沉淀，去除沉淀，然后再行锰含量的测定。
原子吸收分光光度法由于灵敏度高，精密度高，选择性好，干扰少以及快速等特点，已被广泛应用于食品中无机元素的测定。
1.样品预处理
根据元素性质及样品来源选用湿消化法或干法灰化法，如用该法测定铜、锌、锰、铁等可选用下列两种方法：①HNO3-H2O2消化法（适用于高脂样品），取均匀样品，加HNO3-H2O2消化液进行消化，直至液体澄清为止，过滤并用水稀释到一定体积，上机；②混合酸消化法，取一定样品加硝酸：高氯酸（4∶1）混合酸消化，直至无色透明，加水煮沸除去多余硝酸，最后用水定容到一定体积，上机。
2.操作条件
根据待测元素及仪器选择最佳条件，如PE403型原子吸收分光光度计测定无机元素，可参考表4-1。
表4-1 测定微量元素工作条件
实验中所用试剂均需优级纯，所用玻璃器皿均必须用稀硝酸浸泡24小时以上，用水冲洗，最后用去离子水冲洗晾干后使用。
（七）硒的测定
食物中硒的测定常选用荧光分光光度法，其基本原理是样品用混合酸消化，使硒化合物氧化为四价无机硒，在酸性条件下，与2，3-二氨基萘（DAN）反应生成4，5-苯并苤硒脑，用环己烷萃取，测其荧光强度。本法适用于各类食物中硒的测定，为国家标准法，检出限为3ng，结果相对偏差≤10%。粮食，蔬菜及其他植物性食物在进行样品处理时，要用不锈钢刀具，干燥温度控制在60℃以下，以防止硒的挥发。
（八）磷的测定
食物中磷的测定可采用喹钼柠酮重量法和钼蓝比色法。前者是将样品经消化后，在酸性条件下，磷与喹钼柠酮试剂生成磷钼酸喹啉沉淀，然后经洗涤、烘干、称重即可算出磷的含量。后者是样品经有机破坏后，在酸性条件下，磷酸盐与钼酸铵作用，产生淡黄色的磷钼酸铵，遇氯化亚锡产生亮蓝色络合物-钼蓝，蓝色强度与磷含量成正比，进行比色定量。适用于各类食物中总磷的测定。
（九）碘的测定
碘的测定有重铬酸钾氧化比色法、硫酸铈接触法、溴氧化碘滴定法等。
重铬酸钾氧化法是样品在碱性条件下灰化，碘被有机物还原并与碱金属结合成碘化物。碘化物在酸性溶液中，与重铬酸钾作用，析出碘溶于氯仿后呈粉红色。当碘浓度低时，颜色的深浅与碘含量成正比，可进行比色测定。样品灰化过程中，加入氢氧化钾的目的是使碘生成难挥发的碘化钾，防止碘的损失。本法显色稳定，重复性好。