1.5　Nano-HA粉体微核试验

微核技术是一种简单、快速、在细胞学水平上筛查染色体损伤的方法，评价材料、药物、放射线及细胞毒性物质对人、动物及体外细胞损伤程度时，按照YY/T 0127进行。微核来源于染色体断裂形成的片断或因纺锤体紊乱形成的整个滞后的染色体。由于某种理化因子的作用，有丝分裂间期的细胞受到伤害，在有丝分裂间期，这种断片落后于向两极移动的染色体，而滞留于细胞质中，当其他染色体复制形成子细胞核时，这些落后的断片在子细胞中演变为微核，形成主核旁边的一个或多个“小核”。微核染色体的结构和颜色深浅同主核相似，转动微调时，与主核处于同一平面，呈圆形或椭圆形，界限清楚，包含于胞浆中，直径为主核的1/20～1/5，并与主核不相连；微核完整，不重叠，但死亡或降解的细胞除外^［25］。各种文献报道中，正常对照的微核数也有很大的差异，但药典中的阳性标准是5‰^［26］。

1.5.1　微核试验方法

选用实验组同溶血试验相同。实验动物为健康昆明小鼠30只，体重为20～25g，将小鼠随机分成6组。阴性对照组与实验组小鼠分别按体重静脉注射剂量为0.1mL/20g生理盐水、材料浸提液、混悬液，阳性对照组按体重注射80mg/kg环磷酰胺，两次腹腔注射染毒，间隔24h。第二次染毒6h后，颈椎离断法处死小鼠，迅速剪下小鼠两条股骨，除去筋膜肌肉，剪去股骨两端，用注射器吸取1mL小牛血清推入骨髓腔中，将骨髓冲洗入离心管中，反复冲洗至骨髓腔中无血。然后以1000r/min的转速离心5min，弃去上清液，用毛细管吹打沉淀物，吸少许均匀涂片。每只小鼠涂片两张，晾干后用甲醛固定，用0.25%M-G染液染色，再以1∶10Giemsa液染色10min，用蒸馏水分色10s，晾干后进行镜检，高倍镜下选择细胞分布均匀、染色好的区域，镜下计数骨髓嗜多染红细胞（PCE）数，PCE在油镜下呈灰蓝色。微核直径相当于PCE的1/20～1/5，呈圆形，边缘光滑，与其他有核细胞核质一样染成紫红色或蓝紫色。一个PCE中出现两个以上的微核按一个微核细胞计，计数每2000个PCE细胞中含微核的PCE数，结果以‰表示。

1.5.2　微核试验结果

微核试验中取每只试验鼠计数2000个PCE细胞，并观察含微核的PCE数，其结果见表1-8。阴性对照组、实验组微核率范围在1.0‰～1.8‰，阳性对照为23.5‰。所有试验组均低于药典的阳性标准5‰，无致突变反应。说明不同分散的Nano-HA均没有造成细胞过度损伤。

表1-8　各组样品微核试验结果比较