1.6 HA局部植入试验
1.6.1 局部植入试验方法
以Nano-HAⅠ（乙醇分散）和Nano-HAⅡ（铈盐分散）为实验组，未进行分散处理的HA为对照组。实验动物为32只新西兰兔，由佳木斯大学动物中心提供，雌雄不限，体重为2.5～3.5kg，普通环境饲养，术后1周、4周、8周和12周取材，每种试验样每个试验期为4只。
手术过程采用速眠新注射液0.3mL/kg肌肉注射，麻醉显效后，动物侧卧于兔台绑定后，于股骨外侧皮肤剪毛，在0.5%碘伏消毒术区，铺无菌手术单，于股骨外侧髁处纵行切开并逐层分离皮肤、皮下组织、肌肉、骨膜，显露股骨外侧髁，用慢速牙钻机与生理盐水冷却下在外侧髁下方骨皮质处钻3个直径为2mm的孔，间隔8mm。用生理盐水反复冲洗创区，充分止血，将预先用生理盐水调和后的干燥成型的不同粉体块材植入创区，在骨植入区外侧分离臀大肌成肌袋3处，植入同种2mm直径的材料，分层对位缝合创口，碘伏消毒创区，术后连续5天每日一次肌注庆大霉素0.5mg/kg、预防感染，并观察动物状态、创口愈合情况。
术后1周、4周、8周和12周，每组试验样各处死4只动物，立即将含修复区周围组织（股骨及肌肉组织的复合组织块体）离体取出，采用生理盐水冲洗后，置于10%甲醛中固定24h；完成骨组织脱钙（脱钙液为硝酸∶甲酸∶蒸馏水=2∶2∶6）后，制作常规组织切片、HE染色，并置于Olympus BH-2型显微镜下观察。
1.6.2 局部植入试验结果及分析
植入试验是用体内植入的方法评价宿主组织对材料的生物学反应。评价的生物学指标包括：纤维化程度；炎症程度；组织变性；界面炎细胞类型；是否存在坏死；材料碎片脂肪浸润；肉芽肿等。对骨组织主要观测骨组织与材料的界面处，应评价植入体与骨的接触面积和植入物周围骨的数量及其间的非钙化组织，以及骨吸收和骨形成的情况。
（1）肌肉植入实验
实验动物一般状况良好，创口无感染，也无植入物排斥反应。肉眼观察，植入部位肌组织无异常，材料与肌肉结合紧密，材料周围无骨组织产生，HE组织学观察见图1-7。1周时，界面周围的肌肉内可见到少量到中等程度的炎症细胞浸润，材料周围可见到不同程度的成纤维细胞和纤维组织增生；4周时，浸润的炎症细胞开始减少，纤维组织、细胞成分逐渐稳定；8周时，纤维包膜变薄，纤维组织长入材料内部；12周时，浸润的炎症细胞消失或已经很少见，周围肌组织始终保持正常结构。各期Nano-HAⅠ组、Nano-HAⅡ组和普通HA组的组织反应略有差异，相对比较8周和12周时，Nano-HAⅠ组、Nano-HAⅡ组发现少量胶原纤维和纤维细胞长入材料间隙中，肌肉组织和材料有的难以分清。
图1-7 植入材料与肌肉组织HE组织学图像×40
—材料；
—肌肉组织；
—纤维组织
（a）HA（1周）；（b）Nano-HA Ⅰ（1周）；（c）Nano-HA Ⅱ（1周）；（d）HA（4周）；（e）Nano-HA Ⅰ（4周）；（f）Nano-HA Ⅱ（4周）；（g）HA（8周）；（h）Nano-HA Ⅰ（8周）；（i）Nano-HA Ⅱ（8周）；（j）HA（12周）；（k）Nano-HA Ⅰ（12周）；（l）Nano-HA Ⅱ（12周）
图1-7 植入材料与肌肉组织HE组织学图像×40
—材料；—肌肉组织；—纤维组织
（a）HA（1周）；（b）Nano-HA Ⅰ（1周）；（c）Nano-HA Ⅱ（1周）；（d）HA（4周）；（e）Nano-HA Ⅰ（4周）；（f）Nano-HA Ⅱ（4周）；（g）HA（8周）；（h）Nano-HA Ⅰ（8周）；（i）Nano-HA Ⅱ（8周）；（j）HA（12周）；（k）Nano-HA Ⅰ（12周）；（l）Nano-HA Ⅱ（12周）
肌内植入试验可见，材料周围无新骨形成，表明Nano-HA无骨诱导活性，同时材料仅引起一过性的炎症反应，并且未见异物反应，从而证实Nano-HA具有高度的组织相容性，植入机体后能很好地被机体“容受”。
（2）骨内植入试验
材料与骨组织HA染色图像见图1-8。1周的脱钙骨组织切片镜下可见材料与骨组织之间无肉芽组织，材料周边有纤维骨痂形成；各组材料亦见大量的纤维骨痂长入材料，材料周围形成纤维组织，周围骨组织对三种材料的反应无明显差异。4周时，Nano-HAⅠ组和Nano-HAⅡ组，材料周围可见大量骨基质出现，纤维骨痂已经开始钙化成骨，但未出现明显的钙化线，生长良好的新生骨组织长入材料内部，材料周围可见成骨细胞；对照HA也可见骨基质形成，新生骨长入材料内部。8周时，Nano-HAⅠ和Nano-HAⅡ材料周围已有大量的新生骨组织，并可见染色较浅的骨基质新沉积于材料周边，骨纤维形成钙化线，新生骨胶原纤维组织呈同心圆排列，即将形成哈佛氏系统；对照HA组亦见有新生骨形成，但并未见哈佛氏系统的形成。12周时，可见Nano-HAⅠ和Nano-HAⅡ已可见较成熟的骨组织，但骨纤维排列尚欠规则，骨创完全愈合，新生骨与周围骨相接成为一体，充填的材料基本消失，材料周围的骨已趋于成熟，有成熟的骨陷窝，已形成较成熟的哈佛氏系统；对照HA可见大量新生骨生长，有一定量残留的材料，哈佛氏系统少见，新生骨的成熟程度较差。
图1-8 植入材料与骨组织界面HA染色图像×40
（a）HA（1周）；（b）Nano-HA Ⅰ（1周）；（c）Nano-HA Ⅱ（1周）；（d）HA（4周）；（e）Nano-HA Ⅰ（4周）；（f）Nano-HA Ⅱ（4周）；（g）HA（8周）；（h）Nano-HA Ⅰ（8周）；（i）Nano-HA Ⅱ（8周）；（j）HA（12周）；（k）Nano-HA Ⅰ（12周）；（l） Nano-HA Ⅱ（12周）
骨对种植其内的材料的响应，将有两种修复过程发生，并相互竞争。一种是普通机制，骨组织在材料周围将形成纤维包裹；另一种可能是如移植骨一样，材料在界面及邻近区域允许或刺激新骨形成。骨内植入试验显示出Nano-HA有良好的骨组织相容性；可以提高骨创的愈合能力，材料周围有明显的新骨形成，材料与新骨之间无纤维膜形成，最终材料被降解掉，材料所在区域被新生骨组织取代，材料与骨髓组织相容性好，并且不影响骨髓组织的新生。