第五章　反应性氧代谢在肾损伤中的作用

体内的细胞在代谢及其生物反应过程中产生一系列反应性氧代谢产物（ROS），可简称为活性氧。过多的活性氧可以通过氧化DNA、蛋白质、多元不饱和脂肪酸等方式，尤其是脂质的过氧化反应造成肾脏损伤，加速肾脏功能的进展。过去ROS被认为只是一类损伤细胞的毒性物质，新近研究发现ROS还可通过调控细胞信号通路转导、促进细胞表型转化等多种机制发挥重要的生物学作用。

第一节　反应性氧代谢物的组成、来源及其病理生理作用

一、反应性氧代谢物的组成

ROS是生物体内有氧代谢过程中产生的活性产物。体内的氧在正常情况下接受四个电子，直接变成水。但在生物体中，氧也能部分还原产生可能有毒性的活性氧，目前研究中最主要的有六种含氧的自由基包括超氧阴离子O₂-、羟自由基OH-、过氧化氢H₂O₂、过氧化脂类（LOOH）、单线态氧（1O₂）和水（H₂O）。ROS的标准氧化还原电位高，氧化能量强，具有一定的毒性。

超氧阴离子和过氧化氢是反应性氧代谢产生的原发性化学物质[1]。反应过程中，铁盐起催化作用，超氧阴离子使Fe3+还原成Fe2+，Fe2+还原H₂O₂成OH-。

二、反应性氧代谢物的来源及其病理生理作用

ROS产生过程需要多种酶的参与，包括环氧化酶（cyclooxygenase）、脂氧化酶（lipoxygenase）、线粒体电子转运链（mitochondrial electron transport chain）、黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、细胞色素P450单氧化酶（cytochrome P450 monooxygenase）、血红素氧化酶（heme oxygenase）及NAD(P)H氧化酶等[2,3]。

病理情况下，细胞内的氧代谢平衡被打破，抑制了线粒体清除氧自由基的能力，促进了ROS在体内的堆积。在缺氧情况下，大量ATP被水解成为ADP和AMP，并进一步被5’核苷酸酶代谢成为腺苷和次黄嘌呤核苷。次黄嘌呤核苷又进一步通过黄嘌呤氧化酶催化为能够产生黄嘌呤和过氧化氢的次黄嘌呤。黄嘌呤氧化酶亦可帮助黄嘌呤产生尿酸和过氧化氢，加重肾脏髓质微环境的损伤。

血管细胞中存在多种重要的血管源性ROS，其形成是由于O₂氧化为O₂-，在SOD作用下，歧化成H₂O₂，H₂O₂在催化酶或GSH-PX作用下转变成H₂O，或与Fe2+起反应生成OH-。此外，O₂-与NO快速反应生成ONOO-。

NAD(P)H氧化酶催化由氧和NAD(P)H作用产生的超氧阴离子，见下面的反应：NAD(P)H+2O₂→NADP++H++2O₂-。NAD(P)H氧化酶在巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞中大量存在，并成为ROS的主要来源。由NAD(P)H氧化酶产生的氧化剂包括过氧化物歧化产生的H₂O₂，2O₂-+2H+→O₂+H₂O₂。H₂O₂的代谢反应受到中性白细胞的髓过氧化酶（myeloperoxidase，MPO）调节，可产生高度毒性的ROS，包括次氯酸（HOCl）、O₂-、H₂O₂、OH-。

体内的一氧化氮（NO）合成与ROS产生之间有密切关系。体内的一氧化氮主要由一氧化氮合酶（NOS）作用产生。根据NOS表达的调节，将其分为三型：Ⅰ型主要存在于神经细胞，神经型NOS；Ⅱ型主要存在于巨噬细胞和中性粒细胞，称为诱导型NOS；Ⅲ型主要存在于内皮细胞，称为内皮型NOS。Ⅰ型和Ⅲ型在生理状态下即有表达，Ⅱ型一般在生理状态下不表达，在受细胞因子刺激后呈诱导性表达。活化的NOS可催化L-精氨酸中5个电子发生氧化，产生NO和瓜氨酸。

NO是一种具有广泛生理活性的旁分泌调节剂，脂溶性小分子，有一定水溶性，在液体介质中可快速弥散，能自由穿透细胞膜而无损耗，因此可作为细胞内和细胞间的气体信号分子。NO与氧及其代谢产物之间的反应，是体内最重要的生物反应。NO与氧均能以气体形式相互作用生成二氧化氮（NO₂），但在液态环境中两者相互作用主要生成亚硝酸盐（NO₂-）。进入血流的NO能与血红蛋白迅速结合，生成硝酸盐（NO₃-），NO₂-和NO₃-缺乏细胞活性，可作为NO代谢的终末产物从尿中被排出。生理上，血管内皮细胞产生NO，通过激活可溶性鸟氨酸环化酶形成血管扩张的cGMP，调节全身的血管张力，是调节髓质和肾小球毛细血管血流必需的。而在许多病理状态下，激活的炎症细胞可产生大量NO。通过细胞因子的作用，肾脏固有细胞触发产生大量ROS。

新近研究发现，NO自身毒性并不十分强，但当过氧化物超氧阴离子同时产生增多时，两者可迅速发生反应，生成不稳定的中间产物，过氧化硝酸盐（ONOO-）[1]。在气体环境中ONOO-可迅速分解为OH-和NO₂；但在液体环境中，ONOO-可在碱性成分中以阴离子形式稳定存在。尽管存在时间不长，但ONOO-可使组织中硫基氧化，产生高度细胞毒性；还可作为氧化剂通过复杂机制，使铁硫中心、锌指结构以及蛋白质硫基等生物分子发生氧化；ONOO-还可使SOD的酪氨酸硝基化，从而易化缺血后细胞演变，使高剂量SOD丧失组织保护作用[4-6]。

第二节　反应性氧化代谢物在肾脏疾病中的作用

ROS研究一直是肾脏病学者关注的热点问题，其可通过多种机制损伤肾脏，包括：直接损伤细胞DNA；活化和转录因子；改变细胞表型；影响细胞信号转导系统以及诱导肾小管上皮细胞凋亡等。体内还同时存在ROS的清除体系，使机体内的ROS处于动态平衡，不致引起机体损伤。机体存在两类抗氧化系统：①酶抗氧化系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等；②非酶抗氧化系统，包括维生素C、维生素E、谷胱甘肽（GSH）、α-硫辛酸、类胡萝卜素、微量元素铜、锌、硒等。两者之间的失衡启动了与超氧自由基产物的相关机制，从而对诸如脂蛋白修饰、转换和细胞功能及代谢产生损伤，还可对葡萄糖和糖蛋白的自身氧化作用和抗氧化酶的糖化作用产生影响[7]。

一、ROS中不同产物相互作用促进肾脏疾病进展

（一）超氧阴离子和过氧化氢

肾小球肾炎时的白细胞是产生O₂-和H₂O₂的主要来源，两者均与肾小球基底膜损伤和蛋白尿的发生密切相关。给予某些实验性肾炎动物SOD歧化O₂-、以过氧化氢酶分解H₂O₂，以去铁胺或对羟基苯甲酸螯合Fe2+阻止OH-生成、用二甲亚砜或二甲基硫脲增加谷胱甘肽过氧化物酶活性进而促进H₂O₂分解，均可减少肾炎动物的蛋白尿[8]。在体外培养的肾小球系膜细胞中，研究发现低密度脂蛋白（LDL）可刺激细胞增殖或肥大以及经血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）依赖的NAD（P）H氧化酶产生O₂-，进而激活局部组织RAS产生血管氧化应激反应。而应用Ang Ⅱ 1型（AT1）受体拮抗剂氯沙坦可阻断过多的O₂-产生，提示LDL产生O₂-作用是经AT1受体介导；而O₂-进一步使NO产生减少，其相互作用可能导致细胞增殖和细胞外基质沉积[9-11]。此外，H₂O₂经肾动脉注入可导致蛋白尿，但并不影响肾血浆流量和GFR。低剂量的H₂O₂在体外可刺激培养的鼠系膜细胞增殖。H₂O₂在体外刺激足细胞，导致足细胞特异性蛋白nephrin和podocin表达下降，线粒体失功，足细胞损伤[12]。

（二）一氧化氮及其衍生的氧化剂

NO通过CGMP引起血管扩张，使肾小球血流动力学改变，从而调节GFR。其与O₂-作用产生的ROS也可能改变GFR。有证据显示ROS可减少肾小球和系膜细胞的表面积，增加肌球蛋白轻链磷酸化，提示它们能调节系膜细胞面积，因此修饰超滤分数，使GFR降低。推测前列腺素和血栓素产生的增加是各种实验性肾小球疾病包括抗GBM病、多柔比星产生的肾病综合征和补体引起的肾损伤的蛋白尿和/或GFR下降的重要介导剂。通过激活环氧化酶，ROS和NO能增加前列腺素和血栓素合成。因此，NO及ROS可能在调节GFR和肾血流量的改变中起重要作用。此外，肾脏疾病过程中，氮自由基（RNS）与ROS的相互作用对细胞反应十分重要，如在巨噬细胞凋亡相关调节中，利用ox-LDL和NO供体可触发转录因子P53和低氧诱导因子1α（HIF-1α），蓄积在人巨噬细胞中的P53和HIF-1α伴有ox-LDL产生自由基（如O₂-），NO拮抗这个过程，而O₂-调节NO诱导的HIF-1α稳定性。因此，ROS信号和RNS信号的相互作用对疾病状态下细胞病理反应十分重要[13-15]。目前研究认为，NO在肾脏疾病的作用中具有两面性：急性炎症期NO过多对组织有害，而在病变的慢性期，NO可能通过与肾脏局部RAS的相互作用而具有抗细胞增殖和抗纤维化的作用[9-11]。

（三）髓过氧化物酶-过氧化氢-卤化物系统（MPO-H₂O₂-Cl）

在肾小球和肾小管间质疾病中，中性多形核白细胞和单核细胞衍生的ROS可能有助于蛋白质、脂质和核酸的氧化修饰。MPO作为一种血红素蛋白和脂蛋白氧化的催化剂存在于上述细胞中。然而MPO激活后能从存在氯离子的H₂O₂中产生次氯酸/次氯酸盐，由此作用中MPO-H₂O₂-Cl系统可产生各种含氯蛋白质和脂质加合物，可能引起肾脏不同部分细胞的功能障碍。MPO-H₂O₂-Cl也可通过与其他氧化剂之间的相互调控发挥有益的作用，如：MPO-H₂O₂-Cl系统能拮抗NO-ONOO-途径，MPO衍生的氯胺（chloramine），特别是牛磺酸氯胺（taurine chloramine）有抗炎症作用，牛磺酸氯胺能抑制白细胞产生细胞因子，阻断MCP-1，自由基产生和巨噬细胞中NO合成，MPO-H₂O₂-Cl还能下调NADPH氧化酶活性[16-18]。近年来，通过测定尿MPO介导的蛋白质、脂质，碳氢化合物改变以及对反应性MPO依赖的氧自由基和氮自由基进行免疫组织学和生化研究，已经得到了一些MPO参与人肾小球和肾间质疾病发病的证据。MPO遗传性缺陷患者的流行病学研究和MPO多形性研究将有望使MPO和它的氧化产物在肾脏疾病的作用进一步得到阐明[16]。

二、炎症性肾脏疾病中反应性氧代谢物的作用

大量研究已经证实了ROS在炎症性肾小球肾炎中起到重要作用[19]。在患者患败血症或全身炎症反应综合征（systemic in flammatory response syndrome，SIRS）时，微血管血栓形成缺血坏死涉及肾小球炎症和肾小管坏死，反应性氧代谢物在其中也发挥重要作用[20]。

自20世纪90年代起人们开始逐渐认识到白细胞中产生的ROS作为氧化剂的作用及其与肾脏病理生理现象的相关性。大多数炎症性肾小球疾病表现为蛋白尿，肾小球滤过率改变和某些病理形态改变。表2-5-2-1显示了支持ROS具有与这些病理生理状态相关的生物学作用的证据。

目前认为，在肾小球肾炎中，循环的多形核白细胞通过内皮迁移、黏附、浸润到免疫复合物沉着的系膜区和内皮细胞下。各种可溶性的微粒刺激能激活中性粒细胞和单核细胞，释放大量ROS和NO衍生的氧化剂。一些免疫反应物，如C3b受体刺激剂、Fc受体刺激剂以及免疫复合物和补体可触发细胞的氧化反应。NOS除产生NO外，还能产生O₂-和H₂O₂。在患寡免疫复合物性坏死性血管炎和新月体性肾小球肾炎患者的血循环中存在抗中性粒细胞胞质抗体（ANCA），可使中性粒细胞产生大量O₂-。因此，在炎症性肾小球损伤中激活的中性粒细胞或单核细胞可能是氧化剂的重要来源。其中，ROS中的次氯酸或MPO-H₂O₂-卤化物可激活明胶酶；氧化剂还能灭活α1蛋白酶抑制剂进而增加对蛋白酶解损害的敏感性，因此释放弹性酶使肾小球基底膜的细胞外基质成分遭受损伤，氧化剂还能损伤肾小球基底膜的肝素硫酸蛋白多糖合成。因此，白细胞产生的ROS可直接损伤肾小球基底膜引起蛋白尿。研究显示，ANCA引起的中性粒细胞耗竭能防止抗GBM）病的异源相的蛋白尿；抗单核细胞抗体耗竭单核细胞能防止抗GBM病自体相的蛋白尿，这些结果均支持白细胞介导了肾小球损伤相关的蛋白尿。

如前所述，反应性氧代谢产物（reactive oxygen metabolite，ROM）的作用还可通过对血流动力学的调节作用影响肾小球血管和系膜细胞而调节肾小球滤过率；MPO和H₂O₂均可导致血小板聚集，内皮细胞肿胀和上皮细胞损伤，从而造成肾小球结构损伤。低浓度ROM还可通过系膜细胞中核转录因子NF-κB激活细胞内其他信号途径。

目前，在不同类型的炎症性肾小球疾病中均获得了ROS作用的证据：

（一）狼疮性肾炎

对狼疮性肾炎的患者研究显示，免疫复合物的沉积可激活炎症细胞释放大量的一氧化氮（NO）、超氧阴离子和其他活性氧自由基（ROS），使机体产生氧化损伤，加重肾脏损害[21]。另有研究表明，NO是一种活性很强的自由基，在狼疮性肾炎活动期，NO水平增高，体内循环免疫复合物沉积于肾小球和肾小管间质中，激活补体，趋化炎症细胞聚集并释放大量的NO、超氧阴离子[22]。姜红等[23]发现，SOD可阻断ROS连锁反应，抑制脂质过氧化，具有保护细胞膜、激活多种辅酶的功能，与GSH-px和GSH一道在清除ROS、对抗ROS造成的氧化损伤中发挥作用，在狼疮性肾炎活动期，SOD、GSH-px和GSH因消耗增加导致体内含量明显下降，因此狼疮性肾炎活动期患者抗氧化能力明显下降。

（二）ANCA相关性血管炎

在ANCA阳性的坏死性肾小球肾炎中，显著的中性粒细胞和单核细胞浸润和ANCA分别结合到中性多形核白细胞的MPO或PR3表位，是此类ANCA相关性小血管炎的常见特征。在以MPO免疫的鼠中，以溶酶体的酶浸出液和H₂O₂灌注，可导致肾小球毛细血管内血栓形成，随后出现增生性肾小球肾炎，表现为肾小球毛细血管壁坏死、毛细血管外细胞增殖、中性粒细胞和单核细胞浸润并有血管炎。以ANCA激活的中性多形核白细胞可结合到血管内皮层，产生超氧阴离子和H₂O₂，H₂O₂可进一步加速HOCl的产生和不依赖NO合成酶的非酶性NO形成，导致肾脏损伤。

（三）新月体肾炎

抗GBM病是一种最具特征性的补体和中性粒细胞依赖性的肾小球损伤，其病变与中性粒细胞和巨噬细胞产生的大量超氧阴离子、H₂O₂和NO密切相关。OH-清除剂dimethiourea、ONOO-清除剂deferoxamin、过氧化氢酶以及NOS抑制剂N-monomethl-L-arginine等均可显著减少此类肾炎动物模型的蛋白尿。

三、反应性氧代谢物在蛋白尿相关肾脏疾病中的作用

在多种蛋白尿相关的原发或继发性肾小球疾病中，ROS的产生主要来源于损伤的肾脏固有细胞，部分与局部活化的单核巨噬细胞也参与ROS的产生。ROS与抗氧化防御机制之间的失衡是肾病综合征足细胞损伤的重要机制之一。建立实验性肾病综合征大鼠模型，用抗氧化酶预处理实验动物可以减轻足细胞病变、预防蛋白尿的产生，说明ROS可能介导足细胞损伤。在膜性肾病、微小病变肾病、局灶节段硬化性肾炎的动物模型中，均发现超量产生的ROS与足细胞损伤有关。ROS影响肾小球内皮细胞和上皮细胞，破坏正常的肾小球选择通透性，给予动物抗氧化剂能显著防止足突融合和蛋白尿。

（一）微小病变肾病

在类似人类微小病变肾病的嘌呤霉素氨基核苷模型研究中，提示ROM起到重要作用。证据包括[24]：①当外源性嘌呤霉素氨基核苷加入刚分离的肾小球或培养的肾小球上皮细胞时，可产生超氧阴离子、H₂O₂和OH-增加；②ROM清除剂可显著减少模型组的蛋白尿；③硒缺乏的饮食显著减少谷胱甘肽过氧化物酶，可增加蛋白尿；④糖皮质激素可产生抗氧化剂酶，能增加SOD活性，清除超氧阴离子，从而减少蛋白尿。

（二）局灶节段性肾小球硬化症

Daehn[25]等应用可特异性活化足细胞中的TGF-β通路，诱导局灶节段性肾小球硬化的转基因小鼠，用多柔比星诱导肾小球硬化，促进足细胞释放内皮素。内皮细胞损伤后，释放大量ROS，小鼠蛋白尿迅速增长、肾功能急剧进展；当抑制内皮素受体或阻断线粒体损伤激发的ROS反应时，可显著阻断足细胞损伤，减少蛋白尿和肾功能进展。Binder等用逆转录病毒插入导致Mpv17基因失活的小鼠模型模拟FSGS，发现Mpv17在ROS的过氧化物酶代谢中起着重要作用[26]。与野生型小鼠相比，Mpv17基因失活的小鼠肾小球中生成并释放出大量ROS分子，诱导足细胞病变，产生大量蛋白尿，加重肾脏损伤。

（三）膜性肾病

被动的Heymann膜性肾病模型是一种补体依赖、非中性粒细胞依赖的肾小球疾病模型，类似人类膜性肾病。ROM在膜性肾病模型中发挥重要作用。证据包括[24]：①肾小球中显示存在H₂O₂；②OH-清除剂、铁螯合剂减少蛋白尿；③喂缺硒食物产生谷胱甘肽过氧化物酶显著减少，加重蛋白尿；④喂缺铁食物减少蛋白尿。目前认为，OH-激发脂质过氧化物是被动性Heymann肾炎出现蛋白尿的关键因素。脂质过氧化物造成的基底膜损伤可能改变肾小球基底膜的通透性，参与蛋白尿的发生机制[1]。

（四）糖尿病肾病

近年来，Brownlee教授提出线粒体电子传递链在电子传递过程中导致的过氧化物产生过多是高血糖诱导血管损伤的共同机制，其核心是高糖引起线粒体中超氧阴离子生成过多，导致组织细胞中发生氧化应激，而氧化应激可引起多元醇通路的激活、糖基化终末产物（AGEs）的形成、蛋白激酶C（PKC）途径及氨基己糖途径的激活，引起细胞代谢功能紊乱，最终导致包括糖尿病肾病在内的各种慢性并发症。这标志着对糖尿病慢性并发症发病机制的认识有了一个突破性的进展。

葡萄糖在自氧化过程中不产生分子氧，而是产生氧化反应的中间产物，包括超氧阴离子、羟自由基和过氧化氢。体内过度产生的活性氧可交联脂质、蛋白质等大分子活性物质，损伤血管内皮细胞，诱导炎症介质的释放，进一步造成肾脏损伤，加速糖尿病肾病进展[27,28]。其中，NAPDH氧化酶和线粒体电子传递链在高糖诱导的ROS生成中发挥重要作用[29]。ROS在糖尿病肾病损伤发生机制的研究中（图2-5-2-1），发现活性氧除直接损伤血管内皮以外，还可以作为信号通道的传递者，促进高糖诱导的信号通路的转导及介导前纤维化基因合成的转录因子的活化，包括激活信号转导途径如蛋白激酶C（PKC）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）及转录因子如核转录因子（NF-κB）、活化蛋白（AP-l），严格控制血糖和阻断RAS系统激活均可降低ROS产生[28]。研究显示，红杉醇可以抑制2型糖尿病肾病ob/ob小鼠肾脏损伤的进展，主要通过降低malondialdehyde（MDA）、ROS，抗氧化、抑制TGF-β表达发挥作用[30]。牛磺酸可通过降低2型糖尿病大鼠MDA和ROS水平发挥抗氧化作用，降低肾皮质VEGF和nephrin基因表达，延缓糖尿病大鼠肾脏病变进展[31]。在糖尿病肾病患者的肾小球中发现泡沫巨噬细胞浸润，在系膜区K-W结节中发现有氧化修饰的糖基化终产物和糖氧化产物高表达。研究进一步发现，糖基化氧化产物和补体的相互作用可引起肾内动脉中层平滑肌细胞损伤，促进糖尿病肾病的进展[32]。

近期研究显示，NO在糖尿病肾病中的作用中存在争议。NO作为较强的血管舒张因子在血流动力学方面已作了大量的研究，然而学者们在对NO与糖尿病肾病的关系探讨中却得到很多相互矛盾的结论。有学者报道糖尿病肾病患者肾脏内皮型NOS表达增高，提示NO活性是被激活的，参与了肾小球高滤过状态及系膜基质的增生[33,34]。而Ishii等[35]和Tessari等[36]研究中却得出糖尿病肾病时NOS的表达下降的结论。Atul等[37]学者也对高脂喂养2周再注射小剂量STZ后6周的糖尿病大鼠进行研究，发现大鼠体内的NO水平是降低的，而且是通过影响解偶联的内皮型NOS的作用来实现的。Radko和Anderson[38]通过对大量研究结果的荟萃分析提出，体内实验得出NO升高或下降的结论与所观察的糖尿病肾病的特定时期有关，NO升高者多处于糖尿病肾病早期，而NO下降者则多表现在糖尿病肾病的晚期。确切的结论，尚需要进一步细致研究得出。

四、肾小球硬化和肾间质纤维化中反应性氧代谢物的作用

血管紧张素Ⅱ刺激细胞产生活性氧是肾脏病理生理机制中的主要信号传递物质，加速肾脏硬化和间质纤维化[39,40]。研究显示，血管紧张素Ⅱ可上调NADPH氧化酶亚单位，包括NOX1，p47phox，p67phox和p22phox[39]。另有研究显示，血管紧张素Ⅱ通过开放线粒体K_ATP通道[41]和诱导肾小管上皮细胞线粒体NADPH氧化酶亚单位NOX4表达[42]，促进线粒体ROS生成。研究发现，一种肠肽，Ghrelin，通过抑制ROS生成，减轻血管紧张素Ⅱ诱导的小鼠的肾小球硬化和间质纤维化[43]。

新近发现，奈比洛尔（一种选择性的β1受体拮抗剂）可改善肾小管、间质的超微结构，改善线粒体重塑，减轻线粒体损伤，降低NADPH氧化酶活性，抑制氧化应激，减轻肾间质纤维化的进展[44]。

五、急性肾损伤中反应性氧代谢物的作用

（一）缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，IRI）是导致急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）的关键原因之一。IRI诱导肾小管上皮细胞凋亡和坏死的确切机制尚不十分清楚。大量研究表明，肾脏IRI期间可通过氧自由基生成增加、细胞内钙超载、多种凋亡调控基因的表达改变和黏附分子表达增加等途径诱导细胞凋亡，其中氧化-抗氧化平衡系统紊乱可能是IRI导致急性肾小管上皮细胞凋亡和坏死的重要因素之一。研究显示，产生的大量氧自由基可通过多种机制发挥作用，包括：①直接损伤细胞DNA；②使具有酶活性的蛋白质丧失功能；③影响核基因转录，改变细胞表型；④引起细胞膜脂质过氧化；⑤影响细胞信号转导系统等途径诱导肾小管上皮细胞凋亡（图2-5-2-2）。氧自由基对肾小管上皮细胞和肾血管内皮细胞都能造成损伤，外源性SOD、还原型谷胱甘肽以及维生素E等氧自由基清除剂对肾都有一定的保护作用。研究表明，别嘌醇是黄嘌呤氧化酶抑制剂，在肾缺血再灌注模型中，能减少超氧阴离子的生成，减轻肾损害[45]。

（二）中毒性肾损伤

肾脏是体内最主要的代谢器官之一，其主要功能为生成尿液，排泄代谢产物，维持体液平衡和内环境的稳定。正常情况下，机体产生的过多自由基能被抗氧化系统及时清除，使自由基水平处于极低的微量平衡状态，但在化学毒物损伤的情况下，机体无法阻止氧化损伤，使肾脏功能受损，导致肾小球滤过作用降低，体内代谢终产物堆积[46,47]。此外，一些肾毒性药物的应用（如化疗药顺铂、免疫抑制剂及一些抗生素等）均可引起肾脏损伤，氧化应激在其中发挥重要作用。钙调磷酸酶抑制剂，如环孢素A，可通过增加氧化应激，上调H₂O₂诱导的DNA损伤[48]。为了防御活性氧自由基的损伤和破坏，组织和细胞中建立和形成了一整套完善的抗氧化防御系统（SOD、CAT、GsH-Px等）。SOD的主要功能是将氧的单价还原产物O₂-歧化生成H₂O₂，构成氧自由基对机体的第一道防线。因此，SOD经常被用作环境胁迫与水域污染的潜在指标[49]。SOD活性的下降表明肾脏可能受到了氧自由基的攻击，而血清内该酶活性的下降，则进一步表明了整个机体受到超氧自由基的攻击造成了细胞损伤。在脂多糖（LPS）诱导的AKI研究中，发现益母草碱干预，可改善AKI小鼠肾脏功能，抑制氧化应激，下调反应性氧代谢物诱导的IκB磷酸化和转录因子NFκB（P65）的核转移[50]。

（三）造影剂肾病

造影剂肾病（CIN）是医院获得性急性肾损伤的第3位病因，约占医院获得性急性肾损伤的12%[51]。目前认为氧化应激参与CIN的发病。其机制可能与其诱导肾小管上皮细胞凋亡和坏死，尤其是肾脏外髓mTALs和S3节段的近曲小管细胞坏死，及肾脏血管痉挛加重肾脏缺血缺氧反应有关[52]。体外实验中发现，用不同种类的造影剂刺激人肾小管上皮细胞HK-2，造影剂导致细胞活性下降，同时发现造影剂下调了细胞生长、增殖的信号通路关键分子AKT和ERK1/2激活[53]。另有研究发现，造影剂可诱导肾小管上皮细胞中调控细胞凋亡、增殖的转录因子，如FoxO3a、STAT3的活化和失活[54,55]。Xiong等[56]发现非离子型造影剂ioversol可刺激大鼠肾小管皮细胞株NRK-52E细胞产生ROS，ROS进一步诱导NRK-52E细胞凋亡，证实了ROS介导造影剂对肾小管上皮细胞的损伤。Cetin等[57]发现高渗离子型造影剂能使大鼠肾脏脂质过氧化物MDA水平明显升高；Devrim等[58]报道低渗非离子型造影剂iomeprol使肾脏MDA水平升高，而抗氧化酶SOD、CAT和GSH-PX活性没有影响。

六、肾脏替代治疗中反应性氧代谢物的作用

肾脏替代治疗主要包括血液透析、腹膜透析和肾移植。维持性血液透析患者氧化应激增强和氧自由基清除系统的严重损伤，导致ROS产生增多，形成氧化和抗氧化系统失衡，其氧化应激的机制尚未完全阐明，目前研究显示可能与晚期糖基化终末产物、同型半光氨酸血症等刺激ROS生成、尿毒症毒素潴留和自身代谢紊乱导致的抗氧化酶活性降低，以及与血液透析本身透析膜不相容性，透析液污染使内毒素通过透析膜入血，激活单核巨噬细胞，促进细胞内ROS产生等多种因素密切相关[59-61]。方均燕等[62]将40例终末期肾疾病患者分为血液透析治疗组（HD组）和非血液透析治疗组（NHD组）；以同期接受体检的20名健康志愿者作为正常对照组（NC组）。采集各组静脉全血，结果显示与NC组比较，HD组和NHD组的CD3+、CIM+T细胞百分比及CD4+/CD8+比值均显著降低；CD4+T细胞凋亡率上升，增殖率下降；IL-4含量增加，IFN-γ含量减少；血清超氧化物歧化酶（SOD）活性降低，丙二醛（MDA）水平升高。HD组与NHD组CD3+、CD4+T细胞百分比、CD4+T细胞凋亡率和IL-4、IFN-γ含量比较明显增高。相关性分析表明，在终末期肾脏病患者中，外周血CD4+T细胞百分比与其细胞凋亡率呈显著负相关，与细胞增殖率呈显著正相关；CD4+T细胞凋亡率与血清MDA水平呈显著正相关，与血清SOD活性呈显著负相关；细胞培养上清液中IL-4含量与血清MDA水平呈显著正相关。表明ESRD患者处于氧化应激状态，外周血辅助性T淋巴细胞数量减少且相关细胞因子分泌异常。其发生机制可能与诱导CD4+T细胞过度凋亡和Th1/Th2细胞因子失衡使机体免疫功能缺陷发生相关。不同生物相容性的透析器对MHD患者ROS的影响一直是肾脏病学者研究的热点问题，有研究报道聚砜膜比铜仿膜对MHD患者ROS的清楚效果更好[63]。

腹膜透析是治疗终末期肾疾病ESRD的有效方法之一，而超滤衰竭（ultra filtration failure，UFF）是腹透患者退出治疗的主要原因之一[64,65]。目前认为，高葡萄糖腹膜透析液引起细胞内线粒体所产生的活性氧ROS增加[66]，在PD患者腹膜间皮细胞氧化损伤、进而引起UFF过程中起关键作用，但具体机制并不清楚。研究证实[67,68]，高糖腹透液及其反应产物可引起HPMC ROS生成增多，从而导致腹膜间皮细胞的氧化应激损伤，可能是导致腹膜功能受损、通透性发生改变的重要原因之一。体外培养腹膜间皮细胞，发现高糖腹透液可抑制腹膜间皮细胞线粒体呼吸链复合物Ⅲ，抗氧化物酶活性明显下降，同时线粒体ROS明显升高，细胞凋亡增多。过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子（peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α）蛋白的表达随高糖腹透液浓度升高而下降。研究显示，高糖腹透液可能通过抑制PGC-1α蛋白的表达，抑制线粒体呼吸链活性以及抗氧化物酶活性，促进ROS积聚，诱导细胞凋亡[69]。另有研究显示，高糖培养的HPMC可以产生较多的过氧化氢，而作为ROS中的重要一员，过氧化氢已被证实可以导致人多种细胞肥大、衰老，出现细胞周期停滞，而且可以影响细胞周期抑制蛋白P21、P27表达。唐等报道[70]，高糖、外源性过氧化氢均可使腹膜间皮细胞周期发生停滞，且高糖增加外源性过氧化氢的毒性作用；高糖的这种作用与内源性活性氧致P21的表达增加有关，使用抗氧化剂可使之减弱。Lee等[71]体外研究发现高糖可能通过激活腹膜间皮细胞内DAG-PKC、NADPH氧化酶、线粒体的新陈代谢而增加细胞内ROS的生成，并上调FN的表达，ROS不仅是PKC的下游还是上游的信号分子，在高糖诱导腹膜间皮细胞表达FN的过程中发挥信号放大作用。另有研究发现，硫化氢可通过抑制氧化应激反应、抑制caspase 3活性、发挥抗凋亡效应，减轻高糖对腹膜间皮细胞的损伤作用[72]。

此外，在肾移植患者体内、体外实验研究中，亦发现ROS产生增加，氧化应激反应参与了移植宿主的免疫排斥反应[73,74]。环孢素A是肾移植患者最常用的抗排斥反应的免疫抑制剂之一，研究显示，环孢素A对肝肾的毒副作用，主要与线粒体损伤，ROS释放增多，诱导凋亡反应，导致肝肾功能损伤[75]。

综上所述，氧化应激可导致肾损伤，并在多种肾脏疾病发生与进展中起重要作用，肾脏损伤也可加剧氧化应激，两者相互联系，相互影响。如何改善肾脏病患者的氧化应激，从而改善肾损伤患者预后，这是当今学者研究的热点问题。总之，对氧化应激防治的深入研究将在提高肾脏病患者生活质量、降低其死亡率方面具有重要意义。

（刘　娜　庄守纲）

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