第六章　凝血与纤溶异常在肾损伤中的作用

一、凝血和纤溶系统简介

凝血过程主要分为三个阶段：凝血酶原酶复合物形成、凝血酶原激活成凝血酶及纤维蛋白的生成。根据凝血酶原酶复合物形成的途径和参与的凝血因子，凝血过程可被分为内源性和外源性凝血途径。经内源性、外源性途径激活产生的凝血酶原酶复合物将无活性的凝血酶原（FⅡ）激活成为凝血酶（FⅡa），凝血酶又进一步将血浆中的纤维蛋白原（FⅠ）转化为纤维蛋白单体；此外，凝血酶会激活凝血因子ⅩⅢ，将纤维蛋白单体连接形成不溶于水的纤维蛋白多聚体，形成血凝块。体内抗凝的主要物质包括：抗凝血酶（antithrombin，AT）、蛋白C系统、组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）和肝素等（图2-6-0-1）。

纤维蛋白被分解液化的过程称为纤维蛋白溶解，简称纤溶。纤溶过程主要分为两个阶段，即纤溶酶原的激活和纤维蛋白（原）的降解。纤溶酶原在激活物的作用下可水解成纤溶酶，主要的激活物为组织性纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator，t-PA）、尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）、FⅫa和激肽释放酶。激活产生的纤溶酶可将纤维蛋白和纤维蛋白原分解成为可溶性纤维蛋白降解产物（fibrin degradation products，FDP）。纤溶酶特异性较低，对FⅡ、FⅤ、FⅧ、FⅩ、FⅫ等也有部分降解作用。纤溶抑制物主要有：纤溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1）、α₂-抗纤溶酶（图2-6-0-2）。

二、慢性肾脏病时凝血纤溶机制的异常

慢性肾脏病患者常常合并有凝血和/或纤溶的异常，即便是早期慢性肾脏病的患者[1]。例如有研究报道，慢性肾脏病患者内皮细胞释放组织纤溶酶原激活物的功能受损[2]；慢性肾脏病患者循环中纤维蛋白原水平增高，后者与心血管病的风险增加有关[3]。慢性肾脏病患者还有组织因子水平的增高，后者不仅参与血小板的激活，同时还是一种炎症介质，因为组织因子可以激活蛋白酶活化受体-1（PAR-1）和诱导细胞内的炎性信号级联反应[4]。

慢性肾脏病患者中常有肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活，后者有促进凝血的作用。在高血压的患者中，肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活与血浆纤维蛋白原、D-二聚体和PAI-1水平的增加相关，而血浆纤维蛋白原和PAI-1水平的增加与终末器官损害（包括心脏和肾脏）是相关的[5]。在糖尿病肾病患者中，血浆PAI-1水平的升高与血管内皮功能障碍和炎症相关[6]。PAI-1可以抑制纤溶酶相关的细胞外基质转化，刺激巨噬细胞和肌成纤维细胞浸润，调节转化生长因子β1的表达，从而在慢性肾脏病和动脉硬化的进展中发挥致病作用[7,8]。在血管内皮功能障碍的情况下还可以有vWF和血栓调节蛋白的血浆水平升高[9]。其他凝血机制的异常还包括FⅫa和FⅦa活性增加、蛋白C水平增高等。

慢性肾脏病患者常见的凝血纤溶机制的异常见表2-6-0-1[10]。

肾病综合征患者血栓栓塞的风险显著增高。在肾病综合征的状态下，伴随着大量蛋白尿，许多凝血因子从尿液中丢失，包括抗凝血酶Ⅲ（antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ）、蛋白C及蛋白S等；而肝脏合成一些凝血因子增加，包括Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ因子和纤维蛋白原等。此外，最近的实验研究和临床研究都提示肾小球内皮细胞功能的异常在肾病综合征血栓栓塞性合并症中也发挥了重要作用[11]。

三、血小板在肾脏损伤机制中的作用

血小板是外周血中含量最为丰富的细胞成分之一，它最基本的功能是参与止血和血栓形成的过程，但越来越多的研究证实血小板还参与免疫与炎症反应，在肾脏病的发病机制中也发挥重要作用。在慢性肾脏病的患者中，血小板可以发生过度的活化，例如可以表现为在二磷酸腺苷（ADP）或花生四烯酸等血小板刺激物的作用下，血小板表面过度表达GPⅡb/Ⅲa[12]；而作为反映血小板活性的标志物，平均血小板容积可以预测肾病综合征患者对治疗的反应[13]。肾小球疾病时许多因素都可以刺激血小板发生活化，包括血管内皮损伤、基底膜胶原暴露、免疫复合物、补体和血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）；血小板活化后释放多种因子，包括血栓素A2（thromboxane A2，TXA2）、5-羟色胺（serotonin，5-HT）、血小板源性生长因子（PDGF）等。各种生长因子以及凝血纤溶因子、血小板因子4（PF4）、血栓球蛋白β（β-thromboglobulin，β-TG）、黏附蛋白及ADP等，它们在肾脏疾病的发病机制中发挥着一系列的作用，例如PDGF是肾脏疾病中最具代表性的生长因子之一，PDGF信号途径的活化参与系膜增生、基质合成以及肾间质纤维化的过程，在IgA肾病的发病机制中发挥了尤为突出的作用[14]。

血小板活化后可以刺激肾小球系膜细胞的增生。例如系统性红斑狼疮患者的血小板可以刺激肾小球系膜细胞上调细胞表面的CD40并释放可溶性CD40，这一效应是通过与血小板表面的CD154的相互作用而实现的；这一CD40依赖性的效应可以刺激系膜细胞增生并释放TGF-β[15]。此外，血小板释放的5-羟色胺可促进系膜细胞增生；血小板分泌的PF4和血栓球蛋白β能中和硫酸肝素多糖，降低硫酸肝素多糖的抑制系膜细胞增生、抑制胶原纤维形成的作用[16]。血小板与血管内皮细胞发生相互作用，这一过程可以通过直接接触或者通过它们所分泌的免疫因子来实现，因此血小板免疫效应既可以发生在血小板活化的局部，也可以是系统性的[17,18]。血小板与内皮细胞的相互作用如果持续存在，将导致免疫的过度激活而造成组织损伤。活化的血小板可以释放微颗粒（microparticle），后者是循环中微颗粒的主要来源[19-21]，肾病综合征状态下循环中血小板微颗粒显著增加[22]，后者发挥了重要的促血栓形成和促炎症的作用。血小板微颗粒携带黏附分子（如P-选择素）和趋化因子（如RANTES等），血小板微颗粒通过与IL-1β的相互作用可以增加内皮细胞的通透性[23,24]，这一效应在动脉硬化的发病机制中发挥了重要的作用。

血小板除了与肾脏固有细胞发生作用之外，与各种炎症细胞和炎症分子还有广泛的交互影响，从而在肾脏病的炎症免疫反应中发挥了致病作用。

血小板可以与单核细胞发生相互作用，这一作用是通过血小板上的P-选择素以及单核细胞上P-选择素的受体即PSGL-1来实现的，这一相互作用可以导致血小板的活化，诱导产生含有组织因子的微颗粒形成，以及诱导单核细胞的促炎症作用[25,26]。血小板对T淋巴细胞的功能也有一定的影响，包括T淋巴细胞的转运、激活和分化等，例如，血小板释放的血栓素可以促进Th1细胞的分化以及Th17细胞的扩增，从而促进炎症反应[27]。另外，血小板与T淋巴细胞之间可以通过它们表面的CD40和CD40的配体的相互作用，导致血小板RANTES释放和T细胞进一步的募集[28]。

血小板的成分中包含三种颗粒，即α颗粒、致密颗粒和溶酶体颗粒，近年来有研究认为还有第四种颗粒，称为T颗粒[29]。这些颗粒中含有大约60种与免疫炎症有关的因子。例如α颗粒中含有血小板第4因子（PF4）、RANTES、SDF-1和亲血小板碱性蛋白（PPBP）等，它们可以招募并激活其他免疫趋化因子和细胞因子，诱导内皮细胞炎症[30,31]；致密颗粒中含有ADP、血清素、聚磷酸盐和谷氨酸盐等，许多具有免疫细胞的修饰效果，例如谷氨酸盐可以诱导T细胞的迁移[32,33]。

血小板表达多种的Toll样受体（TLR）家族成员，包括TLR1，TLR2，TLR4，TLR6，TLR8和TLR9等[34]，其中研究最为深入的是TLR4，后者可以导致血小板的活化，使血小板黏附于中性粒细胞，促使后者释放中性粒细胞细胞外罗网（neutrophil extracellular traps，NETs），NETs不仅具有抗感染的作用，还在一系列自身免疫性疾病中发挥致病作用，例如系统性红斑狼疮以及原发性小血管炎等[35]。TLR2的激活也可以导致血小板和中性粒细胞的黏附增加[36]炎症因子表达的增加[37]。

四、凝血纤溶异常在肾脏损伤机制中的作用

（一）内皮细胞调控凝血纤溶平衡的作用

内皮细胞具有抗凝和促凝双重功能。生理状态下的内皮细胞发挥着抗血栓形成的作用，维持血液的流动性，这一功能主要是通过以下机制来实现的：①内皮细胞表面带有负电荷，可以抑制血小板和凝血因子的黏附和聚集；②合成和分泌抗凝因子，如分泌血栓调节蛋白（thrombomodulin），可将凝血酶的促凝活性转变为抗凝活性，分泌肝素样物质以增强AT-Ⅲ的抗凝作用；以及组织因子途径抑制因子（TFPI）；③合成和分泌促进纤溶的因子，例如组织纤溶蛋白激活因子（t-PA）；④合成和分泌抑制血管扩张和血小板聚集的因子，例如前列环素；⑤分泌平滑肌松弛抑制因子（endothelial-derived relaxing factor，EDRF）等等。

然而，当由于炎症等原因造成内皮细胞损伤或活化时，内皮细胞将丧失其抗凝活性而发挥促凝活性，并介导炎症与凝血之间的交互作用，主要表现在：①在炎症状态下，巨噬细胞等炎症细胞可以产生大量炎症因子例如肿瘤坏死因子α（TNFα）、补体C5a或IL-1等，它们可以促进内皮细胞合成和表达大量组织因子，同时在炎症状态下，由于内皮细胞受损，分泌组织因子途径抑制因子（TFPI）能力下降（TFPI可以与组织因子、Ⅴ因子和Ⅶ因子形成复合物并抑制组织因子的功能），从而促进外源性凝血途径的激活。②抗凝血酶是重要的对抗凝血物质，但在严重炎症反应时，受损内皮细胞合成抗凝血酶减少[38]。③内皮细胞受损时，血栓调节蛋白分泌和表达下降，补体C4b结合蛋白（C4bBp）水平上升，蛋白S下调，蛋白C系统随之下调，凝血级联反应增强[39]。④在炎症状态下，内皮细胞分泌PAI-1增多，抑制纤溶系统活化。⑤在炎症因子的作用下，内皮细胞表面表达黏附分子异常，从而促进单核细胞和巨噬细胞的募集，这是在新月体性肾炎患者凝血活化中的关键步骤[40-43]。此外，内皮细胞还可以合成和释放一些凝血因子如Ⅷ因子[44]，这些分子机制打破了凝血/纤溶的平衡，导致内皮细胞表面的高凝状态和纤维蛋白的形成，从而破坏了毛细血管的通透性。因此，内皮细胞的直接作用是在肾小球基底膜（GBM）的周围维持炎症状态，并可以成为外部致病因素攻击的靶点。例如，在溶血尿毒综合征时，肠出血大肠杆菌产生志贺毒素黏附在内皮细胞表面的globotriaosylceramide（Gb3）分子上并进入细胞[45]，志贺毒素A亚单位发生水解和二硫键减少，A亚单位激活，抑制蛋白质的合成，导致细胞死亡，并且改变了内皮表面结构；组织因子暴露增加，产生的凝血酶，和血小板结合的纤维蛋白原裂解，导致纤维蛋白形成。

内皮细胞的损伤和功能障碍导致尿蛋白从肾小球漏出，而微量白蛋白尿是肾脏病患者心血管疾病和心血管死亡的独立危险因素，心血管疾病又进一步加重内皮细胞功能的障碍，形成一个恶性循环。

（二）凝血酶与蛋白酶活化受体（PAR）的作用

凝血酶可以裂解纤维蛋白原成为纤维蛋白单体。当凝血酶作用于细胞时，会引发了广泛的效应，如细胞增殖、细胞分裂和细胞的形态和运动性的改变，它诱导下游的信号转导级联，从而影响细胞电生理、代谢过程以及基因的表达。此外，凝血酶在急性和慢性炎症过程发挥着重要功能，例如它可以激活补体级联反应，或者作为免疫效应细胞的有丝分裂原[46,47]。

凝血酶可以直接激活血小板，也可以与特异性的受体即PAR相互作用激活血小板。PAR属于G蛋白偶联型受体家族，凝血酶与PAR结合后导致受体的内部裂解，释放出N端的一段短肽，暴露一个新的氨基末端域，通过分子内相互作用激活受体[48]；之后凝血酶受体可以发生内化[49]。凝血酶与血小板上的PAR结合后，可以引起血小板形态的改变，促使血小板释放ADP、血清素、血栓素以及多种趋化因子和生长因子。此外，它释放出的纤维蛋白原受体糖蛋白GPⅡb/Ⅲa整合素的复合物和P-选择素，并促使CD40配体迁移至血小板表面，前者可以促进血小板聚集，CD40配体则诱导内皮细胞分泌趋化因子和表达的黏附分子，从而促进白细胞的募集和白细胞外渗。凝血酶也可以引发血管内皮细胞的效应，包括形态和通透性改变，动员黏附分子如vWF、P-选择素以及各种细胞因子的产生[50]。

PAR在肾小球内皮细胞、系膜细胞和上皮细胞上均有大量表达，其生物学作用包括：细胞骨架重排、肾小球上皮细胞和成纤维细胞的增殖等。此外，凝血酶上调uPA、tPA及其抑制剂PAI-1的表达，而uPA受体的表达被下调，其净效应是纤维蛋白形成的纤维蛋白溶解系统功能的减退[51]。在肾小球性肾炎和溶血尿毒综合征的患者中，肾小球细胞的表面上的PAR-1蛋白的表达水平下调，而mRNA的表达上调[52]，这提示凝血酶激活PAR-1后使得后者内化[53]。此外，在抗肾小球基底膜（GBM）抗体病的动物模型中，通过PAR-1介导的凝血酶促炎症细胞的效应与其促凝血效应同等重要。水蛭素是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在动物实验中它可以显著降低肾小球病变，包括如巨噬细胞浸润、纤维蛋白沉积和新月体形成等，但应用PAR-1敲除的方法可以达到同样的效果。TRAP肽是一类具有激活PAR-1的活性但是缺乏凝血酶的蛋白酶活性的多肽，它可以减轻肾小球的损伤[54]。

PAR在许多免疫细胞上也有表达，包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、淋巴细胞和肥大细胞，凝血酶也影响这些细胞的功能。凝血酶可以趋化单核细胞，调节成纤维细胞产生细胞因子；同时，它也调节PAR信号的过度反应[55,56]。在补体系统中，活化的凝血酶能绕过了补体的经典途径、旁路途径和凝集素途径，活化C5产生C5a来触发补体活化[57]。然而，这一特质不限于凝血酶，凝血系统中许多丝氨酸蛋白酶均有此功能。凝血酶是凝血系统和补体系统交互作用的重要桥梁之一。此外，凝血酶促进激活各种促炎症途径，包括产生促炎性细胞因子（如肿瘤坏死因子、IL-1β和IL-6）和细胞因子，从而又反过来刺激凝血[46,57-59]。

（三）纤维蛋白的作用

越来越多的证据表明纤维蛋白（原）和纤维蛋白降解产物在炎症反应中发挥了作用[60]。在大多数情况下，纤维蛋白（原）的促炎功能是由于它与多种免疫细胞通过受体-配体的作用而实现的[61]，而且，纤维蛋白（原）这些促炎症功能的信号转导途径并不与凝血系统中其他因子的促炎症作用相交叠。例如纤维蛋白（原）可以与白细胞上的CD11b/CD18整合素受体相结合，激活促炎症途径如NF-κB，导致在局部产生炎性细胞因子，如TNF-α和IL-1β[62-64]，这一结合是通过纤维蛋白原的377～395氨基酸（特别是383～395）实现的[65,66]。单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和某些B细胞上也可以结合纤维蛋白原[67,68]。另外，纤维蛋白原可以与肥大细胞上的αⅡbβ3结合，导致肥大细胞的激活，对于调节血压水平有一定作用[69,70]。

此外，纤维蛋白原还可以直接或间接通过一些其他的受体、黏附分子或细胞表面蛋白参与炎症过程。例如，纤维蛋白原可以通过TLR-4诱导巨噬细胞活化，释放趋化因子和细胞因子，包括MCP-1，巨噬细胞炎性蛋白-1、IL-6、IL-8、TNF-α、基质金属蛋白酶-1和基质金属蛋白酶-9等[71,72]。血纤维蛋白原通过血管内皮细胞钙黏蛋白（vascular endothelial cadherin）、ICAM-1以及几种整合素受体与内皮细胞、血小板、血管平滑肌细胞、白细胞相互作用，在血管疾病中发挥致病作用[73]。

由于纤维蛋白是凝血反应的最终产物，因此在研究凝血纤溶在肾小球肾炎的发病机制中的作用时，通常认为纤维蛋白是关键的环节。纤维蛋白凝块可以使肾小球毛细血管的血流量减少，导致肾小球缺血和坏死，并吸引巨噬细胞和白细胞。在动物实验中，去纤维蛋白的治疗可以减轻肾小球肾炎的严重程度[74]；而且在纤维蛋白原A-α链缺乏的鼠中可以不发生新月体性肾炎[75]。因此，肾小球纤维蛋白沉积不仅仅是肾脏局部凝血/纤溶异常的病理产物，同时纤维蛋白沉积还具有重要的促炎症作用。

纤维蛋白在纤溶酶的作用下形成纤维蛋白降解产物（FDP），FDP有类似纤维蛋白的趋化作用，因此可能也在肾小球肾炎的发病机制中起一定的作用[76]。

（四）纤溶酶原激活物和纤溶酶原的作用

在肾小球的急性损伤中，凝血系统和纤溶系统的活性都是增强的，但纤溶系统的活性受到抗纤溶物质例如PAI和/或α2-抗纤溶酶（α2-AP）的影响，活性增强得并不显著。在抗GBM抗体病的动物模型中，Malliaros等发现肾小球内纤溶活性显著降低（40倍），肾小球上清组织纤溶酶原激活物（tPA）活性降低10倍，尿激酶（uPA）活性是不变的，而纤溶酶原激活因子抑制因子-1（PAI-1）的活性则增加了5倍[77]。有趣的是，在新月体性肾炎的患者中，尽管纤溶酶原激活物包括uPA以及tPA的mRNA水平上调，但纤溶活性可以减低[78]。然而，在抗GBM病的动物研究中，tPA和纤溶酶原基因敲除小鼠相对于野生型小鼠病情更为严重，表现为更多的新月体、更多的纤维蛋白沉积和更严重肾衰竭，而抑制uPA及其受体uPAR的基因对小鼠的预后却影响不大，尽管uPA-/-小鼠肾小球的炎症细胞浸润更为严重。这些结果提示uPA和tPA的发挥了致病作用。肾小球内皮细胞所产生的tPA可能是局部纤溶酶原激活物的主要来源，参与清除肾小球的纤维蛋白[79]。

从20世纪80年代起，重组tPA（rtPA）开始在动物实验中用于新月体肾炎的治疗。由于在纤维蛋白的作用下tPA的酶活性会增强，所以它比其他纤溶药物包括尿激酶和链激酶的出血风险小。Remuzzi等rtPA用于抗GBM病的动物研究，未发现严重的出血事件，且可以减少新月体的形成、改善肾功能[80]，这提示在新月体肾炎的早期对抗纤维蛋白的治疗可能具有保护作用。Haraguchi等研究了tPA在抗Thy-1肾炎中的作用，他们发现由于局部纤维蛋白的出现，rtPA导致纤溶酶产生的增加，后者不仅参与纤溶的过程，还导致了细胞外基质的重塑，且肾小球TGF-β的含量不受纤溶酶活性增加的影响[81]。然而，近来还有研究发现纤溶酶原可以激活TGF-β[82]。

近来有研究发现，在ANCA相关小血管炎患者血清中存在抗纤溶酶原抗体，其检出率为18%～24%，抗纤溶酶原的抗体与ANCA相关小血管炎的疾病活动度以及肾功能水平相关，进一步的研究发现，该抗体可以降低纤溶酶原的功能、抑制血栓的溶解，并参与炎症反应[83,84]。在部分系统性红斑狼疮合并抗磷脂抗体综合征患者循环中也能检测到该抗体，但其临床意义尚待进一步研究[85]。

尿激酶（uPA）及其受体（uPAR）在肾脏病的免疫炎症反应中也发挥了积极的作用。例如有观察性研究显示，局灶节段性肾小球硬化症患者血中可溶性uPAR水平较正常对照和微小病变肾病患者明显升高，在肾病综合征缓解时水平下降[86]；尿中可溶性uPAR的水平亦是如此，进一步的研究发现，可溶性uPAR可以促进足细胞运动能力的增强[87]。在炎症因子如IL-1β和TNF-α或细菌内毒素的作用下，许多细胞表达uPA的水平增加，包括内皮细胞、上皮细胞、单核细胞和中性粒细胞等[88]，而这种局部释放的uPA又通过与uPAR的作用导致中性粒细胞的活化，后者发生迁移和氧自由基的释放[89]；uPA还可以使结合在细胞上的纤溶酶原转化成纤溶酶，导致促炎症因子的释放，激活基质金属蛋白酶，从而放大了急性炎症反应[90]。

（五）溶酶原抑制物（PAI）的作用

PAI-1是纤溶酶原抑制剂中最主要的一种，它是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的糖蛋白，通过与tPA和uPA结合限制产生纤溶酶。PAI-1也参与细胞黏附和细胞迁移：PAI-1通过阻断uPAR、整合素αVβ3玻璃体结合蛋白（vitronectin）的相互作用，PAI可以阻止细胞与细胞外基质的黏附。另外三种PAI称为PAI-2、PAI-3（一种蛋白C抑制剂）和蛋白酶连接蛋白1（protease-nexin 1），它们在肾小球病发病机制中的作用尚不清楚。蛋白酶连接蛋白1在鼠的增生性肾小球肾炎模型表达上调，但其意义尚不清楚[91]。PAI-1可以与uPA和uPAR在细胞表面形成复合物，该复合物与uPAR迅速被内化，并由低密度脂蛋白受体相关蛋白介导所降解，因此uPAR可能是PAI-1的清除受体[92]。

在许多类型的肾脏病包括各种原发性肾小球肾炎以及狼疮性肾炎和糖尿病肾病等继发性肾小球病中，都可见到患者血清PAI-1浓度升高和肾组织PAI-1的高表达，PAI-1增加可以导致细胞外基质的聚集，促进肾脏组织纤维蛋白沉积；此外，PAI-1的增多还可抑制基质金属蛋白酶系统（MMPs）的活性，从而减少细胞外基质的降解，促进肾纤维化的进程。例如在糖尿病肾病的动物模型中，PAI-1可以通过上调TGFβ而增加细胞外基质的聚集，并通过抑制纤溶酶和MMP-2的活性而减少细胞外基质的降解[93]；PAI-1基因敲除的鼠可以不患糖尿病肾病[94]。在抗GBM病的动物模型中，PAI-1的基因转录和生物学活性都是增高的，PAI-1敲除的动物病情较轻，表现为新月体比例低、纤维蛋白以及胶原聚集沉积少，而PAI-1过表达者肾脏病变较重[95,96]。血液透析的患者中PAI-1水平是增高的，且PAI-1水平高者容易发生心血管事件，这可能是与内皮细胞功能受损有关[8,97]。腹膜透析患者也有类似的情况[98]。

（陈　旻）

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