第七章　肾脏纤维化的发生机制

肾脏纤维化（renal fibrosis）是含原发性、继发性肾小球疾病，肾小管、间质及血管疾病和肾脏移植慢性排斥性病变在内的所有慢性肾脏疾病（CKD）发展至终末期肾脏病的最后共同通路。其主要病理改变为正常肾单位的丢失，取而代之以大量成纤维细胞及肌成纤维细胞的增生，细胞外基质如胶原纤维和纤粘连蛋白的产生和堆积，从而导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化，最终导致肾脏功能丧失。在高血压和糖尿病肾病中，肾脏纤维化常伴随有小血管的硬化。此外，肾脏纤维化过程中也常伴有慢性炎症反应，如T细胞和单核巨噬细胞的浸润。

目前认为肾脏纤维化是不可逆的进行性病变，由此导致的终末期肾脏病需依赖透析治疗或肾脏移植生存，为此需要耗费大量的财力和物力，对患者、家庭以及社会来说都是沉重的负担。世界各国的肾脏病学者做了大量的工作，试图寻找抗肾脏纤维化的措施，但至今临床上仍缺乏有效可靠的抗纤维化治疗方法，其主要原因之一是肾脏纤维化的发生是一个非常复杂的慢性病理过程。很多细胞介质和生长因子都直接或间接地参与了这一过程，而目前对其发生机制尚缺乏全面的认识。本章的主要目的是阐述目前对肾脏纤维化发生机制的认识和研究上的进展。

一、细胞生长因子在肾脏纤维化发生和发展中的作用

（一）转化生长因子与肾脏纤维化

转化生长因子（TGF-β）是TGF-β超家族的主要成员之一，从De larco和Todaro等[1]在研究病毒时首次发现到现在的几十年中，它与肾脏等多种器官纤维化的关系是一个常讲常新的话题。TGF-β超家族广泛存在于哺乳动物体内，包括TGF-β家族、活化素（activin）、骨形态发生蛋白（BMP）三大类。TGF-β超家族具有广泛的生物学活性，在早期胚胎发生时机体的构建、内分泌功能、组织的纤维化、炎症反应、免疫反应和肿瘤的形成等多种生理病理过程中都具有重要的作用。

TGF-β在机体几乎所有组织中均表达，尤其在骨、肺、肾脏等组织中含量丰富。绝大多数的实质细胞都可以产生和分泌TGF-β，而一些浸润细胞如淋巴细胞、巨噬细胞、血小板等也可释放TGF-β。TGF-β的释放和激活导致细胞外基质（ECM）的生成增多和降解的减少，适量的激活导致正常结构的重塑和损伤的修复，而TGF-β过度的释放则将导致器官和组织的纤维化。在本章节中，我们将重点讨论TGF-β在肾脏纤维化中的作用。TGF-β是一种多功能、具有多向调节作用的细胞因子，它有着非常广泛的生物学活性。它的活性因其剂量、作用细胞的类型、分化程度、外界环境及是否有其他生长因子作用而异。它以自分泌、旁分泌和内分泌的方式通过细胞表面的受体信号传导途径参与细胞分化、增生与凋亡，与机体抗炎症反应、免疫调节、细胞黏附、ECM的合成以及多种肿瘤的发生有关。至今，已有大量的研究显示，TGF-β与肾脏纤维化关系密切。

1.TGF-β的结构、受体信号传导与生物学活性

在体内，TGF-β以无活性复合物的形式存在。机体在内源性蛋白酶的作用下形成12.5kD的TGF-β单体，其单体再以二硫键联结形成有功能的同源二聚体即TGF-β。新合二聚体以非共价键与一种无活性相关肽（latent associate peptide，LAP）形成无活性的休眠复合物，LAP再以二硫键与休眠TGF-β结合蛋白（latent TGF-β binding protein，LTBP）形成大的休眠复合物，储存在血小板α颗粒中或分泌到胞外。新合成的TGF-β是无活性的，它只有被活化，即从基质上释放和从LAP裂解下来后才能发挥生物学效应。机体内大部分的细胞都能合成TGF-β，如内皮细胞等。但静息时的内皮细胞合成TGF-β的量和活性均很低，而激活的内皮细胞即可合成大量且活性很高的TGF-β。血浆中已激活的TGF-β与α巨球蛋白等结合形成的复合物可被肝细胞摄取和代谢，也可由炎症区的蛋白酶或弹性蛋白酶降解。

细胞膜上的TGF-β受体有3型：TGF-β-RⅠ，TGF-β-RⅡ，TGF-β-RⅢ。分子量分别为53kD、70～80kD、300kD。RⅠ和RⅡ与信号传导有关，RⅢ与TCF-β贮存有关。其中Ⅰ型和Ⅲ型受体是丝氨酸/苏氨酸激酶受体，Ⅰ型受体又被称为活化素Ⅰ型受体样激酶（activin receptor-like kinases，ALKs），它又分为7种亚型，ALK-1是一种内皮细胞特异性Ⅰ型受体；ALK-2、ALK-3、ALK-6是BMPI型受体，ALK-4、ALK-5分别是活化素和TGF-β的Ⅰ型受体，而ALK-7的配体目前尚未知。Ⅰ型受体有一个楔形的GS区插入激酶区，使之处于失活状态。Ⅱ型受体是结构性自动磷酸化，它在未与配体结合时，已经发生磷酸化。在信号转导中，TGF-β首先与Ⅱ型受体结合，Ⅱ型受体自身发生二聚化，然后再与Ⅰ型受体结合形成四聚体，使Ⅰ型受体近膜GS区的丝氨酸/苏氨酸残基发生磷酸化并激活，进而磷酸化下游的信号传递介质，促进TGF-β的跨膜信号传导。

Massague等[2]于1996年研究证实Smad蛋白是TGF-β信号传导中的介质。Ⅰ型受体磷酸化激活以后，将信号传至细胞内，使Smad蛋白磷酸化形成二聚体，并进入核内与DNA结合，调节靶基因的表达。TGF-β/Smad信号通路与其他信号通路是相互影响的。有丝分裂刺激可以负向或正向调节TGF-β/Smad信号通路；ERK MAPK在被肝细胞生长因子和内皮生长因子活化后，可以抑制配体所引起的R-Smad在核内的聚集；IFN-γ通过JAK1/STAT1所介导的通路上调Smad7的表达，从而抑制TGF-β信号传导。TGF-β在肾脏纤维化中的生物学活性包括：①对ECM的影响：ECM对维持正常的肾脏结构、影响细胞间的黏附等起着非常重要的作用。正常组织ECM的合成与降解保持着动态的平衡。而TGF-β对细胞外基质蛋白的调节作用主要包括两个方面，一是增加其合成，二是减少其正常的降解，从而促进ECM积聚，这其中含有基底膜成分，如Ⅳ型胶原、Laminin、硫酸肝素等；间质基质成分如Ⅰ型、Ⅲ型胶原、纤粘连蛋白（FN）等。TGF-β促进ECM积聚主要通过激活基质降解抑制酶如组织金属蛋白酶抑制剂（TIMPs）和纤溶酶原激活物抑制剂（PAI）的活性；抑制基质降解酶的活性，如基质金属蛋白酶（MMPs）和纤溶酶原激活物（PA）。②对细胞增生的影响:TGF-β可抑制上皮细胞（肾小管及肾小球上皮细胞）、支气管上皮细胞及内皮细胞生长。对于间充质来源的细胞，如肾小球系膜细胞、成纤维细胞，TGF-β具有双重作用，高浓度时抑制细胞增生，低浓度时促进细胞增生。③对肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化的影响：体外实验中TGF-β可以诱导肾小管上皮细胞转分化为可以产生大量ECM的肌成纤维细胞。

2.TGF-β在肾脏纤维化发生及发展中的作用

在肾脏几乎所有类型的肾脏细胞均可表达TGF-β及其受体。TGF-β的表达与肾脏纤维化的密切关系已经得到了多方面临床与实验研究的证实。如：在基质增多不明显的薄基底膜肾病和微小病变中TGF-β1 mRNA水平与正常肾组织无明显差异，而在以ECM积聚为主要特征的IgA肾病、局灶节段增生性肾小球硬化、新月体性肾小球肾炎、糖尿病肾病等中，其肾小球和小管间质区TGF-β1 mRNA明显增高。这说明肾脏TGF-β的表达与基质的病理性增多有关，与其纤维化的程度成正比。2型糖尿病患者中发现循环TGF-β水平较正常对照组高2倍。另外，在免疫介导的抗胸腺素1（Thy-1）及抗肾小球基底膜（GBM）病实验模型中发现，应用TGF-β中和抗体可有效防止肾小球ECM的沉积。因此认为，TGF-β1是介导ECM沉积的重要因子。在重复注射嘌呤霉素或多柔比星诱导的局灶节段性肾小球硬化及糖尿病肾病模型等非免疫炎症介导肾小球损伤的模型中，TGF-β的表达均持续增高，并与ECM成分的增加成正相关。糖尿病鼠血浆TGF-β是正常组的4倍。支持TGF-β诱导肾小球硬化的最直接证据是利用脂质体将TGF-β cDNA经肾动脉导入正常鼠的肾脏，肾小球TGF-β蛋白表达增加，于1周内发生肾小球硬化[3]。这说明TGF-β是ECM沉积、肾小球硬化的强诱导剂。在Kopp等[4]的研究中发现，TGF-β转基因小鼠血浆TGF-β增高至正常的8倍，并伴有明显的肾小球纤维化，说明循环TGF-β和局部生成的TGF-β一样可诱导肾小球基质的堆积增生。体外研究中，高糖培养近曲肾小管上皮细胞、肾小球内皮细胞和系膜细胞时，细胞TGF-β mRNA和TGF-β的水平明显增高，同时伴有肾小球的肥大和胶原等ECM的增多，而抗TGF-β抗体和TGF-β反义寡核苷酸则能拮抗高糖的作用。糖基化终末期产物（AGEs）培养系膜细胞也可以增加其TGF-β的表达和胶原的生成。此外，TGF-β也可刺激培养的小鼠肾小球系膜细胞、上皮细胞、近曲小管细胞合成ECM。

肾小球的病变与肾间质病变往往是相互影响的，这可能与肾小球源性细胞因子释放到肾小管和间质有关。间质纤维化在某种程度上较肾小球的病变更能预示肾脏的损害及临床的预后。肾间质纤维化是以肾小管基底膜的增厚和间质成分如Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原和FN的增多、基质的堆积为特征。在单侧输尿管结扎梗阻性（UUO）肾间质纤维化动物模型中，患肾TGF-β mRNA水平明显增高，而巨噬细胞数量也相应增多。在缺血性肾损害模型中，肾小管上皮细胞TGF-β1表达增高。可见，TGF-β在间质纤维化中也是非常重要的。

3.TGF-β的治疗前景

大量的动物实验和临床研究均已证实了TGF-β与肾脏纤维化的关系，因此，抑制TGF-β的作用对延缓肾脏纤维化的进展将有重要意义。Border等[5]应用天然TGF-β抑制剂Decorin可阻断肾硬化，Ziyadeh[6]等应用抗TGF-β中和抗体可减轻糖尿病肾纤维化的发生和发展，共同提示抗TGF-β可能是防治肾纤维化的新方法。但必须指出的是，应用抗TGF-β抗体虽然可减轻糖尿病肾纤维化，但却加重了肾脏的炎症反应，也可导致肾功能的损害。Ma等[7]发现，应用大剂量TGF-β中和抗体对嘌呤霉素引起的肾炎模型没有保护作用。近期研究成果同样表明[8]，条件性敲除肾小管上皮细胞TGF-β Ⅱ型受体或下游Smad4，在减轻UUO所致肾脏纤维化的同时，也不同程度地增加了损伤区域的炎症反应，包括上调白介素-1、肿瘤坏死因子-α的合成和NF-κB的激活[9]。由此可见TGF-β是一把“三刃剑”，抗TGF-β抗体在抗纤维化的同时也抑制了TGF-β的抗炎症作用和抗免疫作用，并可诱发肿瘤和自身免疫性疾病的发生。因此，还需要更多、更深入的研究来证实抗TGF-β的治疗作用和临床应用前景。

（二）碱性成纤维细胞生长因子与肾脏纤维化

成纤维细胞生长因子（ fibroblast growth factor，FGF）是从大脑和垂体的提取物中部分纯化所得的成纤维细胞有丝分裂原，因其具有刺激成纤维细胞增生的活性而得以命名。它对酸和热敏感，等电点呈碱性，故称为碱性FGF（basic-FGF，b-FGF）。b-FGF是一种单链蛋白，有146～157个氨基酸残基。人机体内几乎各种细胞可产生b-FGF。b-FGF的分泌形式多为自分泌、旁分泌和内分泌，分泌后多与肝素高亲和力结合。b-FGF受体为细胞膜上的膜蛋白，它也是单链多肽。b-FGF与其结合后的信号传导通路有：①诱导腺苷酸或鸟苷酸循环酶；②激发磷脂酶降解磷脂酰肌醇产生第二信使二酰甘油和IP3，然后激活蛋白激酶C并引起钙内流；③b-FGF受体与酪氨酸激酶有关。

在正常肾组织中，b-FGF表达限于肾小球、血管和部分肾小管上皮细胞以及间质成纤维细胞样细胞。在肾脏肾小球内系膜细胞、足突细胞和上皮细胞均有分泌。而其自身也能作用于这些细胞，诱使上述细胞增生。近年来一系列动物和临床研究已证明，b-FGF参与肾脏病的发病过程，与肾脏纤维化密切相关。正常肾脏b-FGF mRNA水平很低，而终末期肾脏病b-FGF mRNA明显上升。b-FGF与肾间质和肾小管细胞的增生呈正相关。同时，b-FGF可以诱导细胞α-SMA的表达升高，而对Ⅰ型胶原和FN合成无明显的影响。此外b-FGF可以降低细胞间黏附分子E-cadherin的表达，并通过诱导MMP-2影响肾小管基底膜的完整性，进而参与了肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转化的发生。体外培养的原代肾皮质成纤维细胞中表达b-FGF及其受体，抗b-FGF抗体可以阻抑b-FGF的促细胞生长作用。有实验者给大鼠注射致肾脏病亚剂量的抗Thy1.1抗体，24小时后再注射b-FGF，结果发现系膜细胞增生增强至5倍以上，而未经处理的大鼠给予相同剂量b-FGF则未见系膜增殖，这表明b-FGF为一种选择性的致细胞分裂剂，能增强亚临床损伤时系膜细胞的增殖。有趣的是，与血小板衍生生长因子（PDGF）能促进系膜细胞合成基质的作用相反，b-FGF对基质合成无影响。b-FGF不仅能诱导系膜细胞增殖，近年研究提示它还可能是肾小球硬化的一个媒介物。Kriz等[10]给大鼠每天注射b-FGF，观察13周。结果出现血肌酐升高和白蛋白尿，发生慢性肾功能不全；组织学上可见典型的局灶硬化。连续观察到足突细胞分裂相和大量多核的足突细胞，但细胞数量并没有增多，这可能因为b-FGF刺激足突细胞进入细胞增生周期引起核分裂。足突细胞为一高度分化细胞，不能完成细胞分裂全过程，所以出现双核或多核细胞。必须指出的是，这些多核细胞可发生变性，表现为胞体萎缩、足突融合，并与肾小球基膜分离。为防止这种分离，壁层细胞就连接到裸露的基膜区，使肾小囊发生簇状粘连样病灶。随着壁层上皮细胞的生长和侵袭，这些改变扩展到邻近的肾小球毛细血管襻，引起粘连和肾小球毛细血管破坏，最后发展为肾小球局灶硬化。

（三）血管紧张素Ⅱ与肾脏纤维化

血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是肾素-血管紧张素系统（RAS）中最为重要的生物活性物质。目前的研究已认识到：它不仅是一种血管活性物质，可引起系统血流动力学改变，导致高血压的发生；更为重要的是作为一种促生长因子，它调节着多种肾脏细胞因子和化学因子的表达以及肾脏细胞的生长、肾脏炎症和纤维化的发生发展，在以进行性纤维化为特征的慢性肾脏疾病的进展中起着非常重要的作用。

1.AngⅡ的生成

AngⅡ的生成有多条通路[11]：①血管紧张素转换酶系统。在这一系统中，肾素将肝脏合成的血管紧张素原转化为血管紧张素Ⅰ，血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转换酶（ACE）的作用下转化AngⅡ。ACE产生于多脏器，包括肺、肝、肾脏、心脏以及大脑。研究发现，在缺乏循环AngⅡ时，组织局部肾素-血管紧张素系统促使肾脏成为局部AngⅡ产生的主要器官。在肾内近端小管液、间质间液以及肾髓质中，AngⅡ的水平较循环中高。②非ACE依赖通路。目前研究表明，体内多种物质具有ACE样作用，可替代ACE将血管紧张素Ⅰ转变为AngⅡ。如血管紧张素原在Tonin、Cathepsin G、组织凝血酶原激活物的作用下直接生成AngⅡ；而血管紧张素Ⅰ在Chymase、Cathepsin G的作用下可直接生成AngⅡ。在肾脏，约有40%的AngⅡ由非ACE依赖的通路来合成。其中，Chymase依赖性通路是AngⅡ产生的另一主要通路。Huang等[12]首先发现，在糖尿病肾脏，Chymase表达明显升高，与肾小球硬化、血管硬化和高血压有密切关系。

2.AngⅡ致纤维化机制

AngⅡ的生物学效应是由特异性的膜受体——血管紧张素Ⅱ受体（AⅡR）介导的。血管内皮上的受体由循环AngⅡ激活，而心脏、血管壁、肾脏等器官中的受体则由以自分泌或旁分泌生成的AngⅡ激活，机体内大量的AngⅡ都是在局部组织中产生的。近年来，在糖尿病肾病等多种肾脏疾病动物模型中均发现，肾脏局部组织AngⅡ浓度是明显增高的。细胞膜上的AⅡR至少分成两类，AT1受体（AT1R）和AT2受体（AT2R）。AT1R广泛分布于几乎所有的组织器官，如肝脏、肺、肾脏、心肌细胞、大脑、血管壁等处，其中肾脏、肾上腺、心脏和动脉中AT1R占优势。TGF-β的产生也是AngⅡ诱导肾脏纤维化的重要机制之一，它通过诱导各种细胞因子特别是TGF-β表达而促使系膜细胞等肾细胞肥大增生、ECM进行性积聚，从而促进肾纤维化的发生发展。近期的研究发现，AngⅡ可以直接激活TGF-β/Smad信号通路介导血管平滑肌细胞、系膜细胞以及小管上皮细胞ECM的生成；同时，在缺乏TGF-β受体的细胞中，AngⅡ可以不依赖TGF-β激活Smad诱导ECM生成。因此，TGF-β非依赖性的AngⅡ/Smad信号通路在肾纤维化中也扮演着重要的角色。通过EGFR，AngⅡ还可以激活ERK MAPK，而EGFR抑制剂（PD153035）可阻断AngⅡ诱导的ERK MAPK依赖的TGF-β和纤维联结蛋白的产生。另外，在成纤维细胞、内皮细胞、血管平滑肌细胞、系膜细胞中，AngⅡ可通过其受体激活细胞内的信号传导链，包括MAPK、酪氨酸激酶、PKC、NF-κB、AP-1等参与肾脏纤维化。AngⅡ也可刺激许多非受体酪氨酸激酶，如PLCγ、Src激酶、JAK、FAK、PI-3K等。

AngⅡ的非血流动力学生物学效应主要表现为其促纤维化作用。①大量的体外研究发现，AngⅡ可促使细胞增生肥大以及ECM的生成。在肾系膜细胞、心肌细胞及成纤维细胞的研究中都发现AngⅡ有促细胞肥大的作用，AT1R拮抗剂则可抑制这种作用。在实验性肾病模型中，AngⅡ有促肾纤维化的作用，ACEI和AT1R拮抗剂均可延缓纤维化进程。目前认为，AngⅡ引起纤维化的机制主要是通过激活许多血管活性物质和生长因子所致，如内皮素-1、TGF-β、血小板衍化生长因子等，其中以TGF-β最为重要。在体外培养的系膜细胞、血管平滑肌细胞以及成纤维细胞中，AngⅡ通过TGF-β依赖的信号通路诱导ECM的合成。②AngⅡ在调节ECM的合成和降解中有非常重要的作用。肾系膜细胞的体外实验结果均显示，AngⅡ的刺激可使其中多种成分，如Ⅰ型胶原、FN mRNA表达和合成增加，而抗TGF-β抗体可明显降低由AngⅡ引起的ECM蛋白增加。有研究表明，抗TGF-β抗体可使FN的合成下降60%左右，提示AngⅡ的促ECM合成作用主要由TGF-β介导。此外其他一些因子，如血小板衍化生长因子、内皮素也参与了这种作用。AngⅡ不仅可使它们的表达增加，也可使其转化为活性形式，产生生物学效应。除了影响ECM蛋白合成外，AngⅡ也影响ECM的降解。AngⅡ上调内皮细胞、平滑肌细胞PAI-1 mRNA的表达，PAI-1的增加可抑制两种纤溶酶原激活剂-组织型纤溶酶原激活物和尿激酶样纤溶酶原激活物，而这两种纤溶酶原激活物可使纤溶酶原转化为纤溶酶，从而使ECM成分降解。纤溶酶也可通过激活金属蛋白酶（MMP）使ECM中各种胶原降解。所以，AngⅡ通过上调PAI-1使ECM降解减少。可见，与TGF-β相似，AngⅡ通过刺激ECM成分合成增加和降解减少而导致ECM聚集和肾脏的纤维化。Araim等在转染了肾素和血管紧张素原基因的小鼠肾小球中发现ECM增加，Ⅰ型及Ⅲ型胶原表达上调，进一步证明了AngⅡ的促ECM聚集作用。

3.抗AngⅡ治疗与肾脏纤维化

AngⅡ在肾脏疾病纤维化进程中的作用越来越受到人们的重视，目前的研究已认识到：它不仅可以改变肾小球血流动力学，而且更为重要的是它具有促生长效应，通过促进肾小球系膜细胞等增生及ECM堆积而导致了肾纤维化的发生和发展。目前，血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）与AngⅡ受体拮抗剂（ARB）已广泛应用于临床治疗糖尿病、高血压及其相关的肾损害和延缓肾脏的纤维化。在糖尿病肾病中，血压的降低已不能完全解释血管紧张素转换酶抑制剂与AngⅡ受体拮抗剂减轻尿蛋白的作用，这说明AngⅡ在介导糖尿病肾病肾纤维化中有非血流动力学的效应[13]。在血压正常的非糖尿病肾病中，AngⅡ的阻断仍有肾脏保护作用也是这一论点的有力证明[13]。在2004年公布的美国K/DOQI高血压治疗与降压药物应用指南中，已经明确了无论有无高血压的慢性肾脏病患者均应首选ACEI或ARB治疗以达到延缓肾功能恶化的目的。但是，AngⅡ在肾脏纤维化进程中复杂的生物学效应以及信号传导通路仍有待进一步研究。

（四）肝细胞生长因子与肾脏纤维化

1.肝细胞生长因子的特性

肝细胞生长因子（HGF）是一种可以促进肝细胞再生的多肽生长因子。人类HGF基因位于7号染色体7q11.2-21位点。其基因的启动子中包含正性和负性调节元素。HGF广泛表达于中胚层来源的器官，无活性的HGF前体在细胞外多种激活物（如丝氨酸蛋白激酶）的蛋白水解作用下或组织损伤时转变为活性形式，形成由69kD的α重链和34kD的β轻链构成的异二聚体。而其特异性的酪氨酸激酶受体c-met主要表达于肝脏、肾脏等组织的上皮细胞，其结构中包括胞膜外50kD的α链和跨膜的含有酪氨酸激酶结构域的β亚单位。当HGF与其受体结合后，即可激活酪氨酸激酶，诱导细胞内的多种信号传导分子的激活，如Gab-1、PLC-γ、Ras-GAP、PI-3K、c-Src、Shp-2、Crk-2以及Grb-2等。在体外培养的细胞中，PKC、PKA激活物cAMP启动因素、多种生长因子及炎症细胞因子可诱导HGF的产生，而TGF-β、AngⅡ、糖皮质激素、1，25-(OH)₂D₃以及视黄酸等可抑制HGF的产生。

2.肝细胞因子在肾纤维化中的保护作用

目前，越来越多的基础和临床研究已证实HGF是一种多功能的细胞因子，具有多种生物学效应：①它具有有丝分裂原效应，可以刺激上皮细胞、内皮细胞以及多种间质细胞增生、分化；②它是一种成形素（morphogen），在器官的发育和维持正常成年器官结构与功能中均有非常重要的作用；③它具有运动（motogenic）效应，可以促进细胞的运动、迁移；④抗细胞凋亡的作用；⑤影响细胞与细胞以及细胞与细胞外基质之间的相互作用，激活蛋白溶解系统，促使细胞外基质降解；⑥诱导肿瘤发生。简而言之，其主要的作用是组织结构发育与再生过程中的构建、重塑与保护功能。

在肾脏组织中，HGF表达于肾小管间质，如内皮细胞和巨噬细胞；在肾小球区域，HGF主要表达于系膜细胞和内皮细胞，以自分泌或旁分泌的形式作用于肾脏上皮、内皮细胞以及系膜细胞。近年来，研究者发现，在肾脏的多种急性或慢性的损伤过程中，HGF表达明显增高。在肾脏毒性物质HgCl₂、glycerol、cisplatin、环孢素、Tacrolimus（FK506）等的作用下或肾缺血、尿路梗阻等病变及各种原因所致的急性肾衰竭、肾移植后急性排斥反应时，肾脏局部HGF mRNA和蛋白水平以及血浆HGF水平均明显增高，而在其他未受损伤的器官组织中，HGF以无活性形式存在。这一现象使得研究者们进一步去研究HGF在肾脏损伤和纤维化过程中的作用。

至今，已有大量的研究结果证实HGF具有肾脏保护作用，可以延缓肾脏纤维化的发生发展。在HgCl₂、环孢素、FK506等肾毒性药物诱导的急性肾衰竭小鼠模型中，HGF可以大大减轻肾脏组织病理改变和肾功能的损害。Okada等[14]用具有肾毒性的中药成分马兜铃酸（aristolochicacid，AA）对HGF转基因小鼠每日进行腹腔注射，结果发现与wild-type组相比，HGF转基因小鼠肾间质纤维化明显减轻；而在体外培养中，即使很低浓度的HGF也可以抑制AA诱导的肾小管上皮细胞的凋亡。在UUO肾纤维化动物模型中，肾小管TGF-βⅠ型受体表达增多，上皮细胞表型向肌成纤维细胞转化，而外源性注射的HGF可抑制肌成纤维细胞的激活，阻断肾小管上皮细胞的转化，抑制FN的沉积，从而抑制肾间质的纤维化。另外，在应用基因转染技术进行HGF基因转染的5/6肾切除大鼠肾脏中，其肾小球硬化和间质纤维化程度较对照组均明显减轻。Mizuno等[15]发现在STZ糖尿病鼠模型中，外源性HGF可以减轻肾小球肥大、抑制系膜Ⅰ型胶原和纤维联结蛋白的生成以及α-SMA的表达，而抗HGF抗体可加重糖尿病的肾脏病理改变；高糖刺激的体外培养的系膜细胞在HGF的作用下，TGF-βmRNA表达减少，Ⅳ型胶原及α-SMA的表达亦降低。

3.肝细胞生长因子抗纤维化的机制

HGF抑制纤维化的现象促使人们进一步去探讨HGF抑制肾脏纤维化的机制。TGF-β是目前公认的致纤维化因子，参与肾脏等多种组织器官纤维化的发生发展。TGF-β的过度表达可以抑制HGF，导致纤维化的发生；而给予外源性的HGF可以抑制TGF-β的表达，抑制纤维化。故目前认为，HGF与TGF-β之间是相互制约、相互拮抗的作用（TGF-βvs HGF counter balance），这正是HGF抑制肾脏纤维化的机制所在。HGF抗肾脏纤维化的作用主要体现在两个方面：①促进ECM的降解[16]：ECM的降解主要通过MMPs/TIMPs和PAI两条通路。而HGF可以增加小管MMP-9的表达，抑制TGF-β在小管间质对TIMP-2和PAI-1的诱导，从而减轻肾间质纤维化。②抑制细胞上皮-间充质表型转化（EMT）：Yang等[17]研究发现，HGF可以维持肾小管上皮E-cadherin表型，抑制TGF-β诱导的α-SMA的表达，他们甚至发现HGF孵育肾间质成纤维细胞后可以重新诱导其间胚叶-上皮的表型转化。他们认为HGF抑制TGF-β诱导的EMT是通过TGF-β非依赖途径。HGF不影响TGF-β诱导的Smad2的磷酸化和与Smad4结合发生核转位，也不影响抑制性Smad7在肾小管上皮细胞的表达，体外研究中发现，它特异性地诱导Smad转录共抑制子（co-repressor）SnoN的表达，与活化的Smad2结合形成无活性的转录复合物，阻断Smad介导基因转录，从而阻断EMT和肾脏纤维化。而Smad转录共抑制子SnoN、Ski在纤维化的肾脏中是明显降低的。

HGF现已在临床上用于肝纤维化的治疗，其在肾脏纤维化中的保护作用也处于研究阶段，但从基础研究到临床应用仍有较长的路要走。如何使HGF特异性地表达于病变的肾脏、如何避免HGF半衰期短、如何既要发挥其抗纤维化作用又不诱导肿瘤的发生等都是将来有待解决的问题。

二、肌成纤维细胞的主要来源及其在肾脏纤维化发生发展中的作用

肾小管间质纤维化是肾脏疾病发展到终末期肾脏病的共有病理改变。这一过程包括了肾小管的缺失和细胞外基质蛋白，如胶原（Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型）、FN和laminin等的堆积。表达α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的肌成纤维细胞不仅是ECM的主要来源，也是肾脏疾病进展过程中的重要标志。它在形态上介于成纤维细胞和平滑肌细胞之间：它可以像成纤维细胞一样合成胶原Ⅰ、Ⅲ；也像平滑肌细胞一样具有收缩性，但与平滑肌细胞不同的是，它具有高度的分裂增生能力。尽管肌成纤维细胞在肾脏纤维化中扮演着重要的角色，但关于其来源目前还存在很多争论（图2-7-0-1）：目前观点认为它可能由肾小管上皮细胞和内皮细胞分别经过EMT和EndoMT（endothelial-myo fibroblast transdifferentiation）转分化而成，也可由周细胞（pericyte）和纤维细胞（local fibroblast）激活产生；此外，诸多证据表明骨髓来源的细胞亦可能是肌成纤维细胞的重要来源之一。

（一）EMT和EndoMT在肾脏纤维化发生和发展中的作用

大量的体外实验结果表明，肾小管上皮细胞在受到刺激时可以逐渐丢失其标志物E-cadherin，并开始表达肌成纤维细胞的标志物α-SMA，这个过程被称之为EMT。TGF-β被认为是启动EMT发生发展的最主要生长因子，它可以通过激活下游Smad3或Smad非依赖的途径（如P38MAPK，Akt/ PKB，RhoA，β-catnnin等[18]）诱导EMT的发生。此外，上皮生长因子（EGF）、b-FGF等生长因子也可诱导体外培养的TECs发生EMT。IL-1β可以通过调节TGF-β的表达与生物活性进而调控EMT[19]。近来研究发现，在糖尿病肾病中，糖基化终末期产物（AGEs）可以通过RAGE以及TGF-β通路的介导诱导EMT，这一现象在慢性糖尿病大鼠和人糖尿病肾病肾活检标本中均有发生。AngⅡ是另一促纤维化因子，并可以加强TGF-β对EMT的诱导，因此它在EMT中亦扮演着重要的角色。在众多的EMT调节因子中，HGF和骨形态发生蛋白-7（BMP-7）对EMT具有负性调节作用。体内外研究均已证实HGF可以阻断EMT。而在5/6肾切除残肾模型以及糖尿病肾病模型中均发现BMP-7可以阻断EMT减轻肾脏纤维化。Strutz等[20]的研究表明，在小鼠抗肾小管基底膜疾病模型中，TECs可以表达成纤维细胞的标志蛋白，即成纤维细胞特异蛋白1（ fibroblast-specific protein 1，Fsp-1）。Ng等人[21]的研究从细胞表型和超微结构方面也证明，在大鼠5/6肾切除的残余肾脏中，TECs可以转分化为α-SMA阳性表达的肌成纤维细胞。与动物研究相似，在人的肾活检组织中同样可以观察到EMT的现象[22,23]。然而，由于检测技术的进步，有研究者提出EMT现象在动物及人类标本中极少发生，最新的研究亦表明，EMT在肌成纤维细胞来源中的贡献可能并没有之前想象中的重要[24]。

内皮细胞亦可能是肌成纤维细胞的来源之一[25]。以内皮细胞的特异性标志物Tie-2、CD31等进行的细胞谱系追踪（cell lineage tracing）结果存在很大差异：内皮细胞来源的肌成纤维细胞从10%～50%不等[24]，这可能是由不同的谱系追踪标志物、检测技术及不同的动物模型造成，尚需进一步的验证：此外，应用Smad3的抑制剂SIS3可以明显抑制糖尿病肾病中EndoMT的发生并减轻纤维化水平，提示TGF-β可通过Smad3依赖性的机制诱导EndoMT的发生[26]。

（二）周细胞和成纤维细胞的转化和激活在肾脏纤维化发生和发展中的作用

周细胞是一种存在于内皮细胞周边的间充质来源的细胞，与1983年在电子显微镜下被首次发现，它位于内皮细胞的管腔面，与内皮细胞紧密相连，在血管的稳定性中发挥了关键的作用。目前尚无合适的标志物区分周细胞和成纤维细胞，其主要区别在于成纤维细胞并不能与内皮细胞发生接触。周细胞有收缩功能，它参与了微血管形成的调控，此外周细胞还存在多向性的分化潜能。Lin等[27]应用在coll1a1启动子和增强子作用下绿色荧光蛋白（GFP）标记的转基因报告小鼠探索了肾脏疾病状态下胶原产生的主要细胞类型，发现位于内皮细胞（CD31+）周围的coll1a1+周细胞的PDGFR-β和TGF-β明显上调，并脱离内皮细胞进入到间质，促进肾脏纤维化。此外，研究者还使用FoxD1-Cre标记了间充质细胞（包括周细胞、血管周成纤维细胞等），并在梗阻性肾病和缺血性急性肾损伤模型中进行了细胞谱系追踪研究，提出了FoxD1+间质衍生的周细胞可能是肌成纤维细胞的重要前体细胞。然而，最新研究对周细胞进行了谱系追踪并实施了特异性的敲除，结果显示敲除NG2+和PDGFR-β+的周细胞并不能减少浸润的肌成纤维细胞数量和纤维化程度，提示周细胞的作用或许并不关键。值得注意的是，后者实验中使用的NG2和PDGFR-β相比与FoxD1，是更可信的周细胞标志物。同时研究者指出，约半数的肌成纤维细胞由肾脏的成纤维细胞增生而成，而EMT来源的肌成纤维细胞也仅占有约5%的比例[24]。

（三）骨髓来源细胞的分化在肾脏纤维化发生和发展中的作用

骨髓来源的细胞（如fibrocyte和巨噬细胞等）在肌成纤维细胞的来源中扮演了重要的角色，最新的细胞谱系追踪实验结果显示，约40%的肌成纤维细胞可能从髓源细胞分化而来[24]。其中，fibrocyte是循环中一种骨髓来源的CD14+单核细胞，它同时表达和白细胞相同的标志物（如CD45）及间充质细胞的标志物（如胶原Ⅰ）。由于细胞表面存在大量的趋化因子受体（如CCR2，CCR7和CXCR4），肾脏疾病时大量的fibrocyte被招募至肾脏损伤部位，在Th2促纤维化类因子的作用下，逐渐转化为肌成纤维细胞；Th1促炎类因子则抑制这个转化过程。巨噬细胞在肾脏炎症性疾病中起着非常关键的作用，其在纤维化疾病中的功能也得到了广泛关注[28]。研究结果显示巨噬细胞的浸润和纤维化的程度高度相关，且与肌成纤维细胞存在共定位。体外实验中，巨噬细胞可以转分化为类似肌成纤维细胞样细胞[29]，提示骨髓来源的巨噬细胞也可能是肌成纤维细胞的来源之一，此观点尚需进一步的证实。

三、信号传导通路在肾脏纤维化发生和发展中的作用

（一）TGF-β/Smad依赖性信号传导通路和microRNA在肾脏纤维化发生和发展中的作用

1.Smads蛋白家族与TGF-β信号传导

Smads蛋白一词来源于Drosophila mothers against dpp（Mad）和C.elegans Sma的融合。Smads蛋白家族是一个在脊椎动物、昆虫和线虫体内发现的转录因子家族，它是迄今为止发现的唯一已被证明的TGF-β受体的作用底物。在哺乳类中共发现了8种不同的Smad蛋白，分成3个不同的亚族：第一类是受体调节型Smads（receptor-regulated Smad，R-Smad），它是Smads蛋白的原型，包括Smad1，Smad2，Smad3，Smad5和Smad8。R-Smads可进一步分为BMP受体激活的Smad1，Smad5，Smad8和由TGF-β激活的Smad2，Smad3两类。第二类是共用Smad蛋白（common Smad，Co-Smad）。它不能被磷酸化，也不能结合TGF-β或BMP受体，但它可以稳定Smads多聚体复合物的结构，使其具有有效的转录活性。目前认为只有Smad4是共用调节分子，它几乎可以与所有活化的R-Smads蛋白结合，形成低聚体复合物，促进R-Smads入核与其靶基因结合，参与调节TGF-β信号传导。第三类Smads蛋白被称为抑制型Smads（inhibitory Smads，I-Smads），其作用是通过阻断R-Smads的激活而抑制TGF-β的信号转导。TGF-β通过Smad2/3诱导Smad7的产生，然而Smad6主要为BMP所诱导，所以Smad7对TGF-β主要起负调节作用。

R-Smads与Co-Smad其N-末端和C-末端具有高度相似的氨基酸序列，分别称为MH1（Mad homology）和MH2结构域。在MH1和MH2结构域之间具有不同序列长度的连接子（linker），但Co-Smad的C末端缺乏SSXS结构（Ser-Ser-X-Ser基序）。除Smad2外，R-Smads与Co-Smad的MH1结构域均可以与DNA的特异序列相结合。R-Smads与Co-Smad的MH2结构域与Smad同聚和异聚复合体的形成是密切相关的。R-Smads的MH2结构域中的L3环决定了其与Ⅰ型受体作用的特异性。Smad1与ALK-1或ALK-2相互作用时，不仅识别L3环，而且还识别MH2结构域中的H1（α-helix）。I-Smads具有一个保守的MH2结构域，可以与Ⅰ型受体相互作用。I-Smads的N-末端与R-Smads和Co-Smad的MH1结构域差异很大，这可能决定了其信号转导的特异性。R-Smad在静息状态下主要以单体存在。在配体的刺激下，与活化的Ⅰ型受体短暂地相互作用后被磷酸化，磷酸化的R-Smads与Co-Smad形成异聚体，使其进入核内与靶基因结合而产生生物效应。

TGF-β超家族包括大量结构相关的多肽因子，如TGF-β、活化素（activin）、骨形态发生蛋白（BMP）三大类。以TGF-β为例，如图2-7-0-2所示，TGF-β首先与细胞膜表面的Ⅱ型受体结合，形成异二聚体复合物，Ⅱ型受体磷酸化Ⅰ型受体近膜GS区的丝氨酸和苏氨酸残基。活化的Ⅰ型受体使R-Smad磷酸化，磷酸化的R-Smad与Co-Smad形成异聚复合体并进入细胞核。在核内Smads可以与DNA结合，然后与许多转录协同子和抑制子相互作用，共同发挥基因转录调节作用。I-Smad与活化的Ⅰ型受体相互作用，使Ⅰ型受体降解，从而抑制R-Smad与活化的Ⅰ型受体结合。Smad7对TGF-β超家族的成员都有抑制作用。STRAP（serine/threonine kinase receptor-associated protein）与Smad7相互作用，将其聚集在TGF-β受体上。目前尚没有发现将Smad6聚集在TGF-β受体上的分子，它可能通过其他途径发挥其抑制作用，如和Smad4竞争结合活化的Smad1；与TGF-β活化激酶（TAK）1协同，干预BMP诱导的P38的激活。因此，Smad6可以在TGF-β超家族信号转导通路的不同水平起作用。TGF-β超家族成员可有效诱导Smad6和Smad7 mRNA的产生。因此，I-Smads可以通过自分泌负反馈方式来控制TGF-β信号的强度和持续时间。

2.Smad2和Smad3在肾脏纤维化中的作用

Smad2和Smad3是Smads家族的重要成员，是TGF-β信号传导的重要介质，但是，它们有共性也有其特殊性，在肾脏纤维化中的作用不尽相同。

Smads家族在结构上有很高的同源性。Smad2和Smad3结构也很相似，其氨基酸序列具有91%的一致性，都包含有一与DNA结合的N-末端MH1结构及启动核转位和调节靶基因转录的C-末端MH2结构。在动物和人糖尿病和梗阻性肾病肾纤维化中，Smad2和Smad3均是明显增加的。在一些体外研究中发现，TGF-β诱导系膜细胞肾小管上皮细胞胶原基质的生成是由Smad2和Smad3共同介导的；高糖刺激系膜细胞、小管上皮细胞、内皮细胞和血管平滑肌细胞生成胶原也依赖于Smad2和Smad3的激活[30]。而过度表达Smad7以抑制Smad2/3可以明显减轻大鼠梗阻肾脏的纤维化[31]。

虽然Smad2和Smad3结构非常相似，但是它们各自起作用的方式和表现形式却不同。Smad3可以直接与DNA结合调节靶基因的活性，而Smad2则需要通过Smad3与其他DNA联结转录因子相结合并影响它们的活性来调节转录。很多致纤维化基因如COL1A1，COL1A2，COL3A1，COL5A1，COL6A1，COL6A3，COL7A1以及MMP-1是Smad3而非Smad2依赖性的[32,33]。据胚胎成纤维细胞9 000个基因分析显示，95%的TGF-β相关基因是Smad3依赖性的[32]。

Smad2和Smad3功能不同的一个有力证据是，Smad2-/-小鼠在胚胎时即死亡，而Smad3-/-小鼠却可以存活。又如，在小鼠胚胎成纤维细胞，TGF-β对MMP-2的诱导是选择性依赖Smad2的，而对c-fos的诱导则依赖Smad3，但是对PAI-1的诱导则需Smad2和Smad3的共同参与。近期发现，TGF-β诱导肾小管上皮细胞VEGF表达依赖于Smad3而不是Smad2。而且，在TGF-β诱导的小管上皮-间质转分化需要Smad2和Smad3，但它们在其中却起着各不相同的作用: Smad2调节上皮基因E-cadherin的丢失，而Smad3调节间质基因α-SMA的表达。最新研究表明，敲除Smad3基因可防止血管紧张素Ⅱ、糖尿病肾病及UUO等致病因素引起的小鼠肾脏纤维化。然而肾脏条件性敲除Smad2则明显加重UUO引起的肾脏胶原I的沉积并抑制胶原的降解，其机制可能与敲除Smad2加强Smad3磷酸化水平、核转位水平及Smad3与下游胶原启动子结合水平有关[34]。综上所述，这些证据进一步证实了Smad3在肾脏纤维化中的重要致病作用。

3.Smad在肾脏纤维化中的治疗作用

（1）Smad7：

Smad7是TGF-β/Smads信号传导通路的主要负调节因子，近年来关于Smad7的研究表明，Smad7在抑制肾脏纤维化中起着非常重要的作用。过度表达Smad7可以抑制Smads信号通路的激活并抑制Smad介导的ECM的合成。在体外的研究中，过度表达Smad7可以抑制TGF-β对肾脏TECs和MCs的致纤维化效应[35,36]。体内研究发现，在梗阻肾病模型中，Smad7转基因可以抑制TGF-β对Smad2和Smad3的激活。美国贝勒医学院的学者用一种新颖、安全有效的诱导基因治疗方法-超声微泡介导系统向肾脏转染doxycycline调控的Smad7基因，发现它可以特异性地阻抑TGF-β/Smad信号通路并减轻大鼠梗阻肾肾脏的纤维化，肌成纤维细胞的增生、胶原基质的生成也明显被抑制[31]。在高血压和糖尿病肾病大鼠中，过度表达Smad7可以完全抑制Smad2和Smad3的激活，减轻肾小球、肾小管间质的胶原基质的生成，并阻止肾功能进行性损害。研究还发现，在大鼠梗阻肾和5/6肾切除肾脏模型中，超声微泡介导doxycycline调控的Smad7可以抑制炎症细胞因子（如IL-1β、TNF-α）、黏附分子（如ICAM-1、VCAM-1）、趋化分子（osteopontin）以及巨噬细胞、T细胞的聚集。这些数据显示，诱导表达的Smad7不仅具有抗纤维化作用，还具有抗炎症和免疫抑制作用。

（2）BMP-7：

BMP-7是TGF-β超家族的成员之一。BMP-7有其特异性的R-Smads:Smad1、Smad5和Smad8。而Smad4是TGF-β与BMP-7的共享成分，它也参与了BMP-7的信号传导。BMP-7通过其Ⅰ型受体ALK-2，ALK-3，ALK-6磷酸化Smad1/5/8，然后与Smad4形成异聚复合体，入核调节基因转录。与TGF-β作用不同，BMP-7在肾小管上皮细胞和乳腺上皮细胞中可以通过Smad5拮抗TGF-β/Smad3诱导的EMT。Zeisberg等[37]发现，在成人肾小管上皮细胞中，TGF-β可以诱导EMT，而BMP-7却可以拮抗其作用，通过增强E-cadherin的表达以维持上皮细胞的表型。在小鼠新月体肾炎模型中，BMP-7可以逆转肾小管上皮细胞EMT，促进肾小管肥大的修复和肾脏排泄功能的恢复。而在慢性肾脏纤维化中，BMP-7表达水平是降低的。

4.TGF-β/Smad依赖的microRNA在肾脏纤维化中的功能与治疗作用

MicroRNA（miRNA）是一类内生的、长约20～24个核苷酸的小RNA，在细胞内具有多种重要的调节功能。成熟的miRNA由miRNA前体（pre-miRNA）经Dicer酶切割而成，可以与靶基因的3’UTR结合从而引导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）降解mRNA或阻碍其翻译。研究结果显示，超过十种的miRNA参与了肾脏疾病的发生发展[38]。值得关注的是，作为最重要的促纤维化因子，TGF-β可诱导miR-21、miR-192、miR-377、miR-382、miR-491-5p的合成，同时降低miR-29和miR-200的水平，而这些miRNA被证明与肾脏纤维化的发生发展密切相关。基于Smad3基因敲除小鼠的miRNA芯片分析的结果进一步提示，TGF-β可能通过激活Smad3调控相关miRNA的表达（如miR-21、miR-29、miR-192）[39]，进而发挥其促肾脏纤维化作用（图2-7-0-3）。

研究表明miR-21在多种肾脏疾病中起致病作用，其中在小鼠梗阻性肾病和糖尿病肾病模型中，间质及小球内miR-21水平均明显上调，且与纤维化程度呈正相关。体外实验结果显示，在TGF-β或高糖环境刺激的小管上皮细胞和系膜细胞中，miR-21可正向调控ECM及α-SMA的合成。而在体沉默miR-21可以明显减轻糖尿病及梗阻肾模型中炎症及纤维化水平。此外，敲除miR-21可以减轻UUO及肾脏缺血再灌注模型中肾小管萎缩及纤维化程度，其机制可能与miR-21抑制过氧化物酶体增生物激活受体-α（PPAR-α）有关。这些研究成果共同提示miR-21可能是潜在的抗纤维化治疗靶点之一。miR-192在正常肾脏组织中高度表达，在系膜细胞和上皮细胞中，其表达可以被TGF-β和高糖进一步激活，功能学结果提示miR-192可通过下调ZEB1/2水平，介导TGF-β的促胶原合成作用；此外，抑制miR-192可以减轻1型糖尿病模型中的纤维化反应和肾功能损伤，其在糖尿病肾病中的致病作用在miR-192敲除小鼠上被进一步验证。miR-29家族包括三个亚型，即miR-29a，b，c。与miR-21和miR-192不同的是，miR-29在多种纤维化疾病中均明显下调，而过表达miR-29则可显著降低梗阻性肾病和糖尿病肾病模型中ECM的沉积和纤维化的程度；体外实验亦提示，这可能是由于miR-29直接靶向结合于含胶原I在内的多种ECM相关基因，抑制其合成，进而减轻TGF-β、高糖及盐引起的纤维化反应。miR-200家族被认为是维持上皮分化的重要调控因素，其成员包括miR-200a，b，c，miR-429和miR-141，研究表明TGF-β可以通过Smad依赖的机制下调miR-200的水平，更重要的是，单次注射miR-200b的前体即可明显减轻梗阻性肾病模型中的肾纤维化程度，因为在上皮细胞中，miR-200家族可以下调E-cadherin的抑制因子ZEB1和ZEB2[40]，进而阻断EMT的发生。然而，由于EMT在肾脏纤维化中的作用近来受到了质疑，我们需进一步探索miR-200抑制肾脏纤维化是否存在其他机制。

综上所述，miRNA在肾脏治疗中的应用潜力已经受到了广泛关注，然而，给药方法及脱靶效应（o ff-target effect）是影响其广泛应用的两大障碍：首先，目前较常使用的是化学合成的寡核苷酸系统性给药，这对非病变组织难免会产生一定的毒副作用，尽管组织特异性的基因导入方法已经得到了证实，为最大程度减少副反应，miRNA剂量的优化也显得格外重要；此外，脱靶效应同样需要得到重视，例如沉默miR-21或过表达miR-29有效治疗纤维化的同时可能会引起细胞的凋亡。这也就意味着miRNA应用于临床纤维化的治疗虽意义重大，但仍任重道远。

（二）非TGF-β依赖的Smad信号传导通路在肾脏纤维化发生和发展中的作用

有不少的证据已证明Smad除了依赖TGF-β被激活外，它也可以被其他非TGF-β依赖的信号通路激活。最近研究表明，多种因子，如EGF、HGF可通过激活ERK/P38 MAPK而促进Smad2/3活化。目前研究表明，ERK/P38MAPK依赖性的Smad2/3磷酸化可以在Smad2/3中间子（linker）或在MH2的N-末端。必须指出的是，不同位点的磷酸化可导致Smad2/3信号传导功能与作用的不同。如EGF引起的Smad2/3中间子的磷酸化可阻断其进入核与靶基因结合，而EGF引起的N末端Smad2的磷酸化可促进其进入核内引起生物学效应。最近的研究发现，在糖尿病的并发症中，AGEs是一关键的介质，它可以不通过TGF-β激活Smad2和Smad3[41]。在肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、血管内皮细胞中，AGEs5分钟时即可激活Smad2和Smad3，30分钟时达高峰。Smad这一快速的激活并不依赖于TGF-β，因为这时用ELISA并不能测到TGF-β，而且，用抗TGF-β抗体也不能阻抑AGEs对Smad的诱导。而且，研究发现在TGF-βⅠ型和Ⅱ型受体突变的细胞中，AGEs依然可以激活Smad。其机制何在?用抗AGEs受体（RAGE）抗体和针对ERK1/2和P38特异性的MAPK抑制剂（PD98059和SB203580）可以抑制AGEs对Smad2/3的诱导，提示Smad的快速激活可能是通过ERK/P38MAPK-Smad的交互作用（crosstalk）通路。24小时后，AGEs可以通过TGF-β依赖通路激活Smad2/3。因此，如图2-7-0-4所示，AGEs介导糖尿病并发症的发生是直接由MAPK-Smad通路介导，间接通过经典的TGF-β-Smad信号通路。而有趣的是，ERK/P38 MAPK抑制剂可以明显抑制AGEs诱导的Smad的激活和胶原的产生，而抗TGF-β抗体只在一定程度上起作用，这说明ERK/P38 MAPK-Smad信号通路是AGEs介导的糖尿病纤维化病理过程中的重要机制。同时，在AngⅡ诱导的高血压动物模型中也发现ERK/P38 MAPK-Smad也参与了纤维化的过程。如图2-7-0-4所示，在体内外的一系列实验中，阻断Smad通路可抑制TGF-β，AngⅡ，AGEs所致纤维化。这一发现提示，Smad可能是纤维化的最后共同通路，而Smad7是阻断这一通路的有效治疗方法。

除了ERK/P38 MAPK通路外，其他信号通路（如JAK/STAT通路、NF-κB等）也可以激活Smads。单一针对TGF-β-Smad信号通路的治疗，如抗TGF-β抗体并不足以抗肾脏纤维化。因此，抗肾脏纤维化的治疗还应从整个纤维化过程中细胞信号转导通路间的网络交互作用来进行全局的考虑。

（三）Wnt/β-catenin信号传导通路在肾脏纤维化发生和发展中的作用

1.Wnt家族及经典Wnt信号传导通路

Wnt基因是从小鼠乳腺癌中克隆出的一种原癌基因，最初被称为Int基因，之后研究发现其与果蝇的wingless基因属同源基因，因而将两者合称为Wnt。Wnt参与了胚胎形成时间充质组织的正常发育，提示其在成纤维细胞的生物学功能及纤维化中可能扮演重要角色。迄今为止，19种Wnt基因（Wnt1，Wnt2，Wnt2b，Wnt3，Wnt3a，Wnt4，Wnt5a，Wnt5b，Wnt6，Wnt7a，Wnt7b，Wnt8a，Wnt8b，Wnt9a，Wnt9b，Wnt10a，Wnt10b，wnt11和Wnt16）在人、小鼠和大鼠等脊椎动物中被发现。其受体包括已发现的10种frizzled（FZD）受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白-5/6等。Wnt主要通过以下3个通路发挥作用：①经典Wnt信号途径即Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）信号通路。②Wnt/Ca2+通路。③平面细胞极性途径（the planar cell polarity，PCP），即Wnt/PCP通路。这其中，Wnt/β-catenin信号通路迄今为止被研究地最为透彻：当Wnt蛋白与细胞表面Frizzled（FZD）受体家族结合后，激活胞内的散乱蛋白（DSH），进而导致一种被称为摧毁复合体（由结肠腺瘤样息肉病蛋白APC、轴蛋白Axin、糖原合成酶激酶3β构成）中关键元件糖原合成酶激酶3β失活，从而抑制了β-catenin的降解使之在胞质中堆积，并进入胞核结合TCF和/或LEF调控靶基因的转录，调控细胞的增殖和分化。

2.Wnt/β-catenin信号传导通路和肾脏纤维化

在多种纤维化模型中，Wnt/β-catenin受到了不同的激活。在梗阻性肾病模型中，He等[42]首次发现，除Wnt-5b，Wnt-8b，Wnt-9b外，其他Wnt亚型及FZD受体、Wnt拮抗剂的表达均明显上调。而导入DKK-1（Wnt拮抗剂）可减少β-catenin在核内的堆积，并显著抑制肌成纤维细胞的激活和胶原的沉积。同样重组sFRP4蛋白（Wnt的另一个拮抗剂）也可通过下调β-catenin减轻肾脏纤维化。研究结果还显示作为Wnt/β-catenin的靶基因，PAI-1参与了其对纤维化的调控。此外，Wnt/β-catenin在不同细胞种属上的功能也被深入研究：条件性敲除肾小管上皮细胞上的β-catenin虽然减少了EMT的发生，却阻断了MMP-7对纤维细胞凋亡的诱导，因此并不能显著减轻肾间质纤维化[43]。最新研究表明，周细胞和纤维细胞特异性过表达β-catenin可明显增加肌成纤维细胞的数量，进而促进肾脏纤维化[44]。在多柔比星诱导足细胞损伤中，Wnt1及下游β-catenin被高度激活，促使肾小球足细胞损伤并加重蛋白尿，而使用帕立骨化醇阻断经典Wnt/β-catenin信号通路则可起到减轻足细胞损伤、减少蛋白尿和抑制纤维化的作用。

在高糖环境下，Wnt4，Wnt5a和β-catenin明显激活。但Wnt/β-catenin通路在糖尿病模型中的作用却存在争议：有研究显示沉默DKK1或转染Wnt4、Wnt5a和β-catenin，可以抑制系膜细胞TGF-β1、纤连蛋白的表达和糖尿病肾病中细胞外基质的沉积[44]，Wnt/β-catenin亦可以参与足细胞的黏附、分化并提高其存活率。然而，足细胞特异性的敲除β-catenin却减轻了足细胞的功能失调和蛋白尿[45]。这些证据共同提示在糖尿病肾病中，适当的Wnt/β-catenin活性可能是维持足细胞功能的重要因素[46]。

（孟晓明　蓝辉耀）

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